Estudi de l'efecte de l'entorn i de mutacions en l'estructura i estabilitat del receptor acoblat a proteïna G rodopsina

Abstract

La rodopsina és el fotoreceptor visual responsable de la visió a baixa intensitat lumínica que es troba en les cèl·lules bastó de la retina. Aquesta proteïna és el model per excel·lència de la superfamília de receptors acoblats a proteïna G (GPCR), que estan constituïts per 7 hèlices transmembrana, i que tenen un gran interès farmacològic. La rodopsina és l'únic membre de la superfamília l'estructura del qual s'ha determinat per difracció de Raigs X. El seu estudi és de vital importància per determinar aquells motius estructurals comuns als GPCR, així com per contribuir a l'elucidació dels trets bàsics d'un mecanisme d'activació comú. A més, l'estudi de mutacions en rodopsina associades a malalties de la retina com la retinosi pigmentària (RP) i la ceguesa nocturna congènita (CNC), ha de permetre determinar les bases moleculars d'aquestes patologies. <br/>L'objectiu principal d'aquesta tesi és aprofundir en l'estudi dels determinants estructurals de l'estabilitat, així com també contribuir a desxifrar els mecanismes moleculars de la RP i la CNC. Per això s'ha estudiat l'efecte de factors externs, com la unió de cations (en particular del zenc), i l'estat de l'entorn lipídic (alterant la concentració del detergent dodecil maltòsid) en l'estabilitat de diferents estats de la rodopsina i del seu cromòfor. També s'ha determinat com afecten l'estabilitat i la conformació de la rodopsina mutacions puntuals associades a la CNC, T94I, i a la RP, L46R; i a la xarxa electrostàtica present entre la part citoplasmàtica de les hèlices 3 i 6 mitjançant la construcció de mutants senzills, dobles i triples en les posicions 134, 247 i 251, els quals s'ha vist que estan implicats en el canvi conformacional de pas a la forma activa. Els mutants s'han obtingut mitjançant tècniques de DNA recombinant, les proteïnes mutades s'han expressat en cèl·lules COS-1, immunopurificat amb l'anticòs monoclonal Rho-1D4, i caracteritzat per espectrofotometria UV-visible.<br/>Els resultats obtinguts demostren que el zenc s'uneix de manera específica a la rodopsina, disminuint la seva estabilitat tèrmica i la seva capacitat d'unir 11-cis-retinal.<br/>També s'ha demostrat que la temperatura provoca la isomerització específica de l'11-cis-retinal a tot-trans-retinal quan aquest es troba unit a rodopsina però no quan es troba lliure en solució. Això reforça la idea de la interacció òptima present entre els aminoàcids de la butxaca del retinal i el cromòfor. <br/>Pel que fa a l'estudi de l'efecte de l'entorn lipídic en l'estructura i estabilitat de la rodopsina, s'ha mostrat que elevades concentracions de detergent desestabilitzen la conformació activa (Metarodopsina II) però promouen la formació d'un fotointermediari inactiu (Metarodopsina III). El detergent, doncs, juga un paper molt important en el desplaçament de l'equilibri entre els diferents fotointermediaris.<br/>En el cas dels mutants associats a malalties de la retina, la mutació T94I disminueix l'estabilitat de la conformació inactiva però estabilitza enormement la conformació activa, indicant un paper rellevant de la T94 en l'estabilització d'una xarxa electrostàtica en l'entorn de la base de Schiff. La mutació L46R en la hèlix 1 i causant de la RP impedeix que la proteïna es processi correctament i arribi a la membrana. Aquest resultat posa èmfasi per primera vegada en la importància de l'hèlix 1 per a l'estructura de la rodopsina i probablement per altres GPCR. <br/>L'estudi dels mutants en les posicions 134, 247 i 251 en la part citoplasmàtica de les hèlices 3 i 6 ha confirmat que aquestes posicions són importants per a l'estabilitat de la conformació inactiva de la rodopsina. Es proposa una paper central de la posició 251 en l'estructura i l'estabilitat de la xarxa eletrostàtica que implica aquestes posicions.