Precise and efficient genome-targeting technologies are needed to enable both systematic genome editing and interrogation of gene function. Although technologies such as designer zinc fingers (ZFs), transcription activator-like effectors (TALENs), and homing meganucleases have begun to enable targeted genome modifications, there is a need for new technologies that are scalable, affordable, and easy to engineer. Easy programmability of the RNA-guided DNA-endonuclease Cas9 of the type II CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) system, using customizable RNAs, brings unprecedented flexibility and versatility for targeted genome modification. Recent studies have demonstrated that Cas9 can be employed as an efficient genome editing tool in human cells, mice, zebrafish, drosophila, worms, plants, yeast, and bacteria. The system enables multiplex genome engineering by programming Cas9 to edit several sites in a genome simultaneously by simply using multiple guide RNAs. Here, we designed a system to regenerate a functional Cas9 enzyme from two genetic constructs that contain the two halves of this gene. This split-Cas9 system aims to eventually offer the possibility of using two viruses as delivery system, to avoid insert size limitations.
Existeix la necessitat de tecnologies de modificació genòmica dirigida, precises i eficients, que permetin tant la sistematització de l'edició genòmica, com la interrogació de les funcions gèniques. Tot i que tecnologies com zinc fingers (ZFs), transcription activator-like effectors (TALENs), i homing meganucleases comencen a permetre modificacions genòmiques dirigides, es requereixen noves tecnologies que siguin assequibles i fàcils de dissenyar. La fàcil programabilitat de la endonucleasa d'ADN dirigida per RNA del sistema tipus II de CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), coneguda amb el nom de Cas9, per mitjà de ARNs customizables, aporta una flexibilitat i una versatilitat sense precedents per a la modificació genòmica. Estudis recents han demostrat que la Cas9 pot ser emprada com una eina eficient d'edició genòmica en cèl·lules humanes, ratolins, peix zebra, drosòfila, cucs, plantes, llevats, i bacteris. El sistema permet dur a terme enginyeria genòmica múltiplex, programant la Cas9 per a que editi diverses localitzacions d'un genoma simultàniament, per mitjà de la utilització de múltiples ARNs guia. En aquest treball s'ha dissenyat un sistema per a regenerar una Cas9 funcional, a partir de dues construccions genètiques que contenen cada una de elles la meitat d'aquest gen. Aquest sistema de split-Cas9 té com a objectiu oferir la possibilitat d'usar dos virus com a sistema de lliurament, i així evitar les limitacions de grandària d'inserció que aquests tenen.
Existe la necesidad de tecnologías de modificación genómica dirigida, precisas y eficientes, que permitan tanto la sistematización de la edición genómica, como la interrogación de las funciones génicas. A pesar de que tecnologías como zinc fingers (ZFs), transcription activator-like effectors (TALENs), y homing meganucleases empiezan a permitir modificaciones genómicas dirigidas, se requieren nuevas tecnologías que sean asequibles y de fácil diseño. La fácil programabilidad de la endonucleasa de ADN dirigida por ARN del sistema tipo II de CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), conocida como Cas9, por medio de ARNs customizables, aporta una flexibilidad y una versatilidad sin precedentes para la modificación genómica. Estudios recientes han demostrado que la Cas9 puede ser usada como una herramienta eficiente de edición genómica en células humanas, ratones, pez cebra, drosófila, gusanos, plantas, levaduras, y bacterias. El sistema permite llevar a cabo ingeniería genómica multiplex programando la Cas9 para que edite diversas localizaciones de un genoma simultáneamente, por medio de la utilización de múltiples ARNs guía. En este trabajo, se ha diseñado un sistema para regenerar una Cas9 funcional, a partir de dos construcciones genéticas que contienen cada una de ellas la mitad de este gen. Este sistema de split-Cas9 tiene como objetivo ofrecer la posibilidad de usar dos virus como a sistema de transferencia, y así evitar las limitaciones de tamaño de inserción que estos tienen.
