Estudio estructural de complejos de oligonucleótidos ricos en adenina y timina con la proteína HMGB1
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Tipus de documentProjecte Final de Màster Oficial
Data2015-09
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Abstract
La familia de proteínas HMGB pertenece a la superfamilia de las proteínas HMG (High Mobility Group), que son las proteínas más abundantes en la cromatina después de las histonas. Las HMGB se unen al surco estrecho del ADN (ácido desoxirribonucleico) con poca o ninguna especificidad de secuencia, a partir de un motivo de unión al ADN denominado HMG-box. Existen dos dominios de HMG-box en las proteínas HMGB, las llamadas box A y box B. Cada una de ellas contiene aproximadamente 75 aminoácidos y presenta un plegamiento característico en forma de L que consta de tres hélices α. A través de estos dominios de unión al ADN, las HMGB inducen cambios estructurales en la cromatina, fomentando la unión de complejos de nucleoproteína que controlan los procesos del ADN, incluyendo la transcripción. Las proteínas HMGB están también implicadas en diferentes enfermedades y algunos tipos de cáncer, por ello su estudio estructural despierta un gran interés en el estudio de estrategias terapéuticas. Con este fin, se busca la obtención de cristales de la proteína HMGB1 con distintos oligonucleótidos.
Para obtener la proteína HMGB1, mediante el empleo de técnicas de ingeniería genética se introdujo en la bacteria Escherichia coli un plásmido que contiene: el gen que expresa la proteína de interés, un gen que confiere a la bacteria resistencia a la ampicilina (para poder seleccionar las bacterias que han incorporado el plásmido) y una cola GST (Glutatión S-transferasa) que facilita la posterior purificación de la proteína. La expresión de la proteína se indujo mediante la adición de IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido). Una vez expresada la proteína, ésta se ha de purificar hasta obtener muestras de elevada pureza para que se puedan cristalizar. Para ello, tras extraer la proteína del interior de la célula, se aplicaron tres técnicas cromatográficas diferentes (cromatografía de afinidad, de intercambio catiónico y de exclusión molecular).
A continuación se realizaron ensayos cristalográficos de distintos complejos HMGB1-ADN con secuencias ricas en adenina y timina mediante la técnica de difusión de vapor en gota colgante. Para encontrar condiciones óptimas de cristalización, se ensayaron distintas variables (relación proteína-ADN, pH, sales, etc.). Tras la obtención de cristales, éstos se pescaron y se congelaron en nitrógeno líquido. Posteriormente se procedió a su difracción mediante rayos X en el sincrotrón ALBA. Los datos obtenidos se procesaron mediante diferentes programas de ordenador para la resolución de la estructura. El método de resolución a emplear fue el de reemplazamiento molecular. A través del análisis de los diagramas de difracción obtenidos se ha resuelto la estructura del ADN, aunque se requiere la obtención de un cristal con más orden para poder precisar la posición de la proteína.
MatèriesChromatin, Oligonucleotides, DNA-protein interactions, Nonhistone chromosomal proteins – Analysis, Crystallography, Cromatina, Oligonucleòtids, ADN -- Interaccions de les proteïnes, Proteïnes cromosomàtiques no histones -- Anàlisi, Cristal·lografia
TitulacióMÀSTER UNIVERSITARI EN ENGINYERIA BIOTECNOLÒGICA (Pla 2009)
Col·leccions
Fitxers | Descripció | Mida | Format | Visualitza |
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Garcia_Gomez_Sonia_TFM.pdf | Memoria | 3,923Mb | Visualitza/Obre |