Analysis and modelling of Trypanosomatidae family in vitro and ex vivo cultures. Chagas disease and leishmaniasis

Abstract

Chagas disease and leishmaniasis cause thousands of deaths every year in the South countries. Those diseases are caused by the protozoa Trypanosoma cruzi and Leishmania spp., respectively. Both protozoa belong to the family Trypanosomatidae and have a digenetic life cycle. That is to say that they live between a vertebrate host and an invertebrate vector through which they are transmitted (sand flies (Phlebotominae) in Leishmania spp. and bloodsucking (Triatomine) in Trypanosoma cruzi). The main objective of this bachelor thesis is allowing the better understanding of Trypanosoma cruzi behaviour in in vitro and ex vivo cultures. As we could demonstrate that the behaviour of in vitro cultures of Leishmania spp. is pretty similar as Trypanosoma cruzi the understanding done with second will be useful for the first. In order to understand them, we have developed two mathematic models: a continuous model of the in vitro growth and an Individual-based Model of the ex vivo growth. The experimental work of in vivo cultures of the two protozoa has been done in the parasitology lab of the Department of Health Microbiology and Parasitology of the Universitat de Barcelona. An experimental method has been designed in order to know the growing curve of the epimastigotes during 20-30 days (no infective, reproductive, extracellular form, from Trypanosoma cruzi and Leishmania spp.) obtaining results that show a bi-lineal growth in the growing phase of the curve. The ex vivo experimental work with Trypanosoma cruzi has been done in the School of Pharmacy of the Ouro Preto Federal University, Brazil. Information from an experimental method that measures the number of infected eukaryotic cells out of the number of counted cells of the culture and the number of amastigotes (no infective, reproductive, intracellular form) in the infected cells for 72 hours. In last this case, the number of infected cells at 72 hours is maxim and the amastigotes number is maxim at 48 hours. From the in vitro results we have developed a continuous model where we can mathematically demonstrate the bi-lineal growth of the cultures and that there is a growing limitation due to the diffusion, or the lack of diffusion, of oxygen in the medium. Likewise, we think about a molecule secreted to the medium that inhibits the growing of the protozoa population in order to control it and facilitate the co-existence between the guest and the parasite. From the ex vivo results we have developed an Individual-based Model that allows us to hypothesize two facts. Firstly, when the tripomastigotes (infective, no reproductive, extracellular form) of Trypanosoma cruzi infect the eukaryotic cells, there may be a change in the membrane composition that does not allow the other trypomastigotes penetrate. Secondly, the complete growing cycle of the amastigotes may be larger than 72h, if not we ought to observe oscillations in their 72 hours behaviour. In order to keep progressing in the understanding of those diseases, is necessary to keep working with both models, as well as start working with in vivo models, since they are further similar at the protozoa's behaviour in humans.

La malaltia del Chagas i la leishmaniasis causen milers de morts anualment en països del Sud. Aquestes malalties estan causades pels protozous Trypanosoma cruzi i Leishmania spp., respectivament. Ambdós protozous pertanyen a la família Trypanosomatidae i el seu un cicle de vida digenètic, és a dir, viuen entre un hoste vertebrat i un vector invertebrat mitjançant el qual es transmeten (flebòtoms (Phlebotominae) en el cas de Leishmania spp. i hemípters predadors (Triatomine) en el cas de Trypanosoma cruzi). L'objectiu principal d'aquest treball de final de grau és avançar en la comprensió del comportament de cultius in vitro i ex vivo del protozou Trypanosoma cruzi. Com que hem pogut demostrar que el seu comportament en cultius in vitro és molt semblant al de Leishmania spp., aquesta comprensió realitzada amb T. cruzi ens serà d'ús per a Leishmania spp. Per fer-ho, s'han desenvolupat dos models matemàtics: un model continu dels creixements in vitro i un model basat en l'individu dels creixements ex vivo. Els experiments in vitro amb els dos protozous s'han realitzat en el Departament de Microbiologia i Parasitologia Sanitàries de la Universitat de Barcelona. S'ha dissenyat un mètode experimental que mesura el perfil de creixement dels epimastigots durant 20-30 dies (forma no infectiva, reproductiva i extracel·lular tant de Trypanosoma cruzi com de Leishmania spp.) obtenint resultats que ens indiquen un clar comportament bilineal en la fase de creixement. Els experiments de creixement ex vivo amb Trypanosoma cruzi s'han realitzat a l'Escola de Farmàcia de la Universitat Federal de Ouro Preto (Brasil). S'ha utilitzat la informació d'un mètode experimental que mesura el nombre de cèl·lules eucariotes infectades en funció del nombre de cèl·lules contades del cultiu i el nombre d'amastigots (forma no infectiva, reproductiva, intracel·lular) presents en cada cèl·lula infectada durant 72 hores. En aquests cas s'ha observat que el nombre de cèl·lules infectades és màxim a les 72 hores i el nombre d'amastigots és màxim a les 48 hores. A partir dels resultats in vitro hem construït un model continu on hem pogut demostrar matemàticament el creixement bilineal dels cultius i on la limitació de creixement es deu a la difusió, o manca d'ella, d'oxigen en el medi. També, podem suposar que hi ha algun metabòlit secretat per els protozous que inhibeix el seu propi creixement controlant el creixement poblacional i facilitant la coexistència amb el hoste. A partir dels resultats ex vivo hem construït un model basat en l'individu que ens ha permès hipotetitzar dos fets. Primerament, quan els tripomastigots (forma infectiva, no reproductiva, extracel·lular) de Trypanosoma cruzi infecten a les cèl·lules eucariotes, aquestes canvien la seva composició de membrana perquè no puguin entrar més protozous. La segona hipòtesi és que el cicle de creixement complet dels amastigots dura més de 72h perquè sinó observaríem oscil·lacions en les gràfiques que representen el seu nombre absolut per cèl·lula infectada. Per seguir avançant en la comprensió d'aquestes malalties, cal seguir treballant amb ambdós models així com començar a treballar amb models in vivo i així aproximar-nos més al comportament en humans.

La enfermedad de Chagas i la leishmaniasis provocan miles de muertos anualmente en los países del Sud. Estas enfermedades son causadas por los protozoos Trypanosoma cruzi y Leishmania spp., respectivamente. Ambos protozoos pertenecen a la familia Trypanosomatidae y su ciclo de vida es digenético, es decir, viven entre un hospedador vertebrado y un vector invertebrado con el que se transmiten (flebotómidos (Phlebotominae) para Leishmania spp. y hemípteros predadores (Triatomine) para Trypanosoma cruzi). El objetivo principal de este trabajo de final de grado es avanzar en la comprensión del comportamiento de cultivos in vitro y ex vivo del protozoo Trypanosoma cruzi. Como hemos podido demostrar que su comportamiento en cultivos in vitro es muy similar al de Leishmania spp., esta comprensión realizada con Trypanosoma cruzi nos será de uso para Leishmania spp. Para hacerlo, hemos desarrollado dos modelos matemáticos: un modelo continuo de los crecimientos in vitro y un modelo basado en el individuo de los crecimientos ex vivo. Los experimentos in vitro de los dos protozoos se han realizado en el Departamento de Microbiología y Parasitología Sanitarias de la Universitat de Barcelona. Se ha diseñado un método experimental que mide el perfil de crecimiento de los epimastigotes durante 20-30 días (forma no infectiva, reproductiva y extracelular de T. cruzi y Leishmania spp.) obteniendo resultados que nos indican un claro comportamiento bilineal en la fase de crecimiento. Los experimentos de crecimiento ex vivo con Trypanosoma cruzi se han realizado en la Escuela de Farmacia de la Universidad Federal de Ouro Preto (Brasil). Se ha utilizado la información de un método experimental que mide el número de células eucariotas infectadas en función del número de células contadas del cultivo y el número de amastigotes (forma no infectiva, reproductiva, intracelular) presentes en cada célula infectada durante 72 horas. En este caso se ha observado que el número de células infectadas es máximo a las 72 horas y el número de amastigotes es máximo a las 48 horas. A partir de los resultados in vitro hemos construido un modelo continuo donde hemos podido demostrar matemáticamente el crecimiento bilineal de los cultivos y donde la limitación de crecimiento se debe a la difusión, o falta de ella, de oxígeno en el medio. También, podemos suponer que hay algún metabolito secretado por los protozoos que inhibe su propio crecimiento controlando así el crecimiento poblacional y facilitando la coexistencia con el hospedador. A partir de los resultados ex vivo hemos construido un modelo basado en el individuo que nos ha permitido hipotetitar dos hechos. Primeramente, cuando los tripomastigotes (forma infectiva, no reproductiva, extracelular) de Trypanosoma cruzi infectan a las células eucariotas, estas cambian su composición de membrada para que no puedan entrar más protozoos. La segunda hipótesis es que el ciclo de crecimiento completo de los amastigotes dura más de 72 horas porque si no observaríamos oscilaciones en las gráficas que representan su número absoluto por célula infectada. Para seguir avanzando en la comprensión de estas enfermedades, es necesario seguir trabajando con ambos modelos, así como empezar a trabajar con modelos in vitro y así aproximarnos más al comportamiento en humanos.