Effect of topographical modification treatments of zirconia on topography, microstructure, and bacterial adhesion

Abstract

Nowadays, the material’s choice for dental implants is increasingly shifting towards zirconia-based ones. Indeed, 3 mol.% yttria stabilized zirconia (3Y-TZP) is recognized as an excellent choice due to its good mechanical properties, aesthetic advantages, and biocompatibility with the human body. Nevertheless, in terms of biological success, it is essential to avoid bacterial infections around the implant and to promote its osseointegration. On this sense, it is well known that the topography of implants strongly influences cell response, which are essential for osseointegration, as well as the bacteria adhesion. Numerous studies have been conducted on this subject, particularly focusing on the modification of surface topography, which significantly impacts the biological properties of dental implants. Various strategies have been used to modify the surface of zirconia, from which laser patterning and chemical etching treatment can be highlighted. Nevertheless, surface treatment can also induce damages and defects that alter the mechanical properties and influence the aging of the zirconia implant. The main goal of this master thesis is to investigate the combination of laser patterning and chemical etching modifications on zirconia and evaluate the effects on the physicochemical properties, microstructure and the antibacterial potential. The samples were prepared through Cold Isostatic Pressing and sintered at 1450 °C. The surface modification process began with the laser treatment, in which a femtosecond (fs-) laser was used to create 3µm periodic linear and grid patterns. This was followed by chemical etching, using a hydrofluoric acid (HF) solution with a concentration of 40% during 1 h. The etching treatment was applied on polished zirconia, and on some of the linear and grid patterns, to evaluate the effects of laser treatment alone, etching alone, and the combination of both. Subsequently, the changes in the topography, wettability, and microstructure were investigated through a series of characterization techniques. This included scanning electron microscopy (SEM) for examining morphology and surface damage; confocal laser scanning microscopy (CLSM) for analyzing the surface roughness and other relevant topographical patterns; X-ray diffraction (XRD) and confocalRAMAN spectroscopy for assessing phase transformation; and measuring the water contact angle to determine the wettability of the samples. Furthermore, a bacteria adhesion study was conducted to assess the response of S. aureus bacteria to the modified surfaces after 4 hours of incubation. This involved counting the number of adherent bacteria on each sample using live/dead staining and CLSM. Then, bacteria adhesion and morphology were further examined by SEM. The results from the topographical characterization indicated that the fs- laser treatment created welldefined and periodic linear and grid patterns, with a depth of approximately 1µm and a periodicity of 3µm, and surface damage in the forms of nanocracks inside of the valleys. In contrast, acid etching resulted in a uniformly nano-rough surface with numerous pits. When both treatments were combined, the laser patterns were almost eliminated, but the roughness was higher than the other samples. XRD and Raman analysis revealed first, that all the treatments slightly increase the monoclinic phase volume (Vm) (%), secondly, only a small layer of grains below the surface is transformed and finally, the distribution of Vm (%) over the surface is non-homogeneous. Furthermore, wettability measurements revealed increased hydrophobicity in all samples using the Wenzel model. Finally, biological characterization results showed a significant decrease in bacterial adhesion on all treated samples, particularly on the ones that underwent only acid-etched treatment. Finally, all the treated surfaces increased the roughness and allowed a reduction of adherent bacteria onto the surface but the combination of laser patterning and chemical etching did not increase the bacteria reduction when compared to the treatments alone.

Actualment, l'elecció del material per a implants dentals està evolucionant cap a materials basats en zircònia. De fet, la zircònia estabilitzada amb un 3 mol.% d’ítria (3Y-TZP) és reconeguda com una excel·lent opció a causa de les seves bones propietats mecàniques, avantatges estètics i biocompatibilitat amb el cos humà. No obstant això, en termes d'èxit biològic, és essencial evitar infeccions bacterianes al voltant de l'implant i promoure la seva osseointegració. En aquest sentit, és ben sabut que la topografia dels implants influeix fortament en la resposta cel·lular, essencial per a l'osseointegració, així com en l'adhesió de les bactèries. S'han realitzat nombrosos estudis sobre aquest tema, centrant-se especialment en la modificació de la topografia superficial, que té un impacte significatiu en les propietats biològiques dels implants dentals. S'han utilitzat diverses estratègies per modificar la superfície de la zircònia, entre les quals es poden destacar la formació de patrons amb làser i el tractament amb gravat químic. No obstant això, el tractament superficial també pot induir danys i defectes que alteren les propietats mecàniques i influeixen en l'envelliment de l'implant de zircònia. L'objectiu principal d'aquesta tesi de màster és investigar la combinació de patrons fets amb làser i el gravat químic en zircònia, i avaluar els efectes d’aquests tractaments en les propietats fisicoquímiques, microestructura i el potencial antibacterià. Les mostres es van preparar mitjançant Premsat Isostàtic en Fred i sinteritzades a 1450 °C. El procés de modificació superficial va començar amb el tractament làser, en el qual es va utilitzar un làser en el règim de femto-segons (fs-) per crear patrons lineals i de graella amb una periodicitat de 3µm. Això va ser seguit per un gravat químic, utilitzant una solució d'àcid fluorhídric (HF) amb una concentració del 40% durant 1 hora. El tractament de gravat es va aplicar sobre zircònia polida, i en alguns dels patrons lineals i de graella, per avaluar els efectes del tractament làser sol, gravat sol i la combinació de tots dos. Posteriorment, es van investigar els canvis en la topografia, mullabilitat, microestructura a través d'una sèrie de tècniques de caracterització. Això va incloure microscòpia electrònica de rastreig (SEM) per examinar la morfologia i el dany superficial; microscòpia làser confocal de rastreig (CLSM) per analitzar la rugositat superficial i altres patrons topogràfics rellevants; difracció de raigs X (XRD) i espectroscòpia Raman confocal per avaluar la transformació de fase; i mesurar l'angle de contacte amb l'aigua per determinar la mullabilitat de les mostres. A més, es va realitzar un estudi d'adhesió bacteriana per avaluar la resposta de les bactèries S. aureus a les superfícies modificades després de 4 hores d'incubació. Això va implicar comptar el nombre de bactèries adherides a cada mostra utilitzant tinció de live/dead i CLSM. Després, l'adhesió de les bactèries i la morfologia es van examinar més a fons amb SEM. Els resultats de la caracterització topogràfica van indicar que el tractament amb làser fs va crear patrons lineals i de graella ben definits i periòdics, amb una profunditat d'aproximadament 3µm, i dany superficial en forma de microfissures dins dels valls. En canvi, el gravat àcid va resultar en una superfície uniformement nano-rugosa amb nombrosos forats. Quan es van combinar ambdós tractaments, la rugositat va ser més alta que en les altres mostres però no homogènia sobre la superfície. L'anàlisi de XRD i Raman va revelar, en primer lloc, que tots els tractaments van augmentar lleugerament el volum de fase monoclinica (Vm) (%), en segon lloc, només una petita capa de grans sota la superfície es va transformar i, finalment, la distribució de Vm(%) sobre la superfície va ser no homogènia. A més, les mesures de mullabilitat van revelar un augment de l'hidrofobicitat en totes les mostres utilitzant el model de Wenzel. Finalment, els resultats de la caracterització biològica van mostrar una disminució significativa de l'adhesió bacteriana en totes les mostres tractades, particularment en les que només van ser sotmeses a tractament àcid. Finalment, totes les superfícies tractades van augmentar la rugositat i van permetre una reducció de bactèries adherides a la superfície.

Actualmente, la elección de materiales para implantes dentales está evolucionando hacia los basados en zircona. De hecho, la zircona estabilizada con un 3 mol.% de itria (3Y-TZP) es reconocida como una excelente opción debido a sus excelentes propiedades mecánicas, ventajas estéticas y gran biocompatibilidad. Sin embargo, en términos de éxito biológico, es esencial evitar infecciones bacterianas alrededor del implante así como promover su osseointegración. En este sentido, es sabido que la topografía de los implantes influye en la respuesta celular, quees esencial para la osseointegración, así como en la adhesión bacteriana. Se han realizado numerosos estudios sobre este tema, enfocándose especialmente en la modificación de la topografía, lo cual tiene un impacto significativo en las propiedades biológicas de los implantes dentales. Se han utilizado varias estrategias para modificar la superficie de la zircona, entre las que cabe destacar la creación de patrones mediante la técnica de laser y el ataque químico. Sin embargo, técnicas también pueden inducir daños y defectos en el material, que alteran las propiedades mecánicas e influyen en el envejecimiento del implante de zirconia. El objetivo principal de esta tesis de tesis es investigar la combinación de las técnicas de patronado láser y ataque químico en zircona y evaluar los efectos en las propiedades fisicoquímicas, la microestructura y el potencial antibacteriano. Las muestras se prepararon mediante prensado isostático en frío y se sinterizaron a 1450 ºC. El proceso de modificación superficial comenzó con el tratamiento láser, utilizando un láser de en regimen femtosegundo (fs-) para crear patrones lineales y de gradilla con una periodicidad de 3 µm. Esto fue seguido por un ataque químico, utilizando una solución de ácido fluorhídrico (HF) con una concentración del 40% durante 1 hora. El ataque químico se aplicó sobre zirconia pulida, y en algunos de los patrones lineales y de gradilla, para poder evaluar así los efectos del tratamiento láser solo, ataque químico solo y la combinación de ambos. Posteriormente, se investigaron los cambios en la topografía, mojabilidad, y microestructura a través de una serie de técnicas de caracterización. Esto incluyó microscopía electrónica de barrido (SEM) para examinar la topografia y el daño superficial; microscopía láser confocal de barrido (CLSM) para analizar la rugosidad superficial y otras medidas topográficas relevantes; difracción de rayos X (XRD) y espectroscopía Raman en modo confocal para evaluar la transformación de fase; y la medición del ángulo de contacto con el agua para determinar la mojabilidad de las muestras. Además, se realizó un estudio de adhesión bacteriana para evaluar la respuesta de las bacterias S. aureus a las superficies modificadas después de 4 horas de incubación. Esto implicó contar el número de bacterias adheridas en cada muestra utilizando tinción en live/dead y CLSM de fluorescencia. Luego, la adhesión de las bacterias y la morfología se examinaron más a fondo mediante SEM. Los resultados de la caracterización topográfica indicaron que el tratamiento con láser fs creó patrones lineales y de gradilla bien periódicos y bien definidos, con una profundidad de aproximadamente 1 µm, y daño superficial en forma de microfisuras dentro de los valles. En contraste, el ataque químico resultó en una superficie homogénea de nano-rugosidad y numerosas cavidades nanometricas. La combinación de ambos tratamientos resulto en la eliminación casi completa de los patrones laser, y en un aumento en la rugosidad comparado en las otras muestras. El análisis de XRD y Raman reveló primero, que todos los tratamientos aumentaron ligeramente el volumen de fase monoclínica (Vm) (%), en segundo lugar, solo una pequeña capa de granos debajo de la superficie se transformó y finalmente, que la distribución de Vm(%) sobre lassuperficies modificadas era no homogénea. Además, las mediciones de mojabilidad revelaron un aumento de la hidrofobicidad en todas las muestras usando el modelo de Wenzel. En conclusión, los resultados de la caracterización biológica mostraron una disminución significativa en la adhesión bacteriana en todas las muestras tratadas, particularmente en aquellas que solo fueron sometidas a tratamiento ácido. Finalmente, todas las superficies tratadas aumentaron la rugosidad y permitieron una reducción de bacterias adheridas.