In high plant density conditions, plants detect changes in the quality of the light they receive and activate a system called the "shade avoidance syndrome", which involves a series of changes in their development to compete with neighbouring plants for light and prevent neighbouring plants shading them. This mechanism is regulated by a large number and variety of proteins, such as the transcription factor PIF7 and the chromatin remodelling protein LHP1, which have been shown to play a crucial role in the regulation of the shade avoidance syndrome. This work focuses on the preparation of the TurboID technique, which allows the analysis of protein-protein interactions to better understand the mechanisms through which these proteins regulate gene expression during response to shade. To carry this out, it is necessary to fuse the TurboID protein (a biotin ligase) with the LHP1 and PIF7 proteins through cloning. Starting from the LHP1-TurboID and PIF7-TurboID protein fusions (called constructs), a transient transformation was performed in the Nicotiana benthamiana tobacco plants. Subsequently, the genetic expression of RNA and the presence of the fused proteins were analysed in vivo through Western Blot and confocal microscopy. Finally, the activity of the biotin ligase of the fused proteins was evaluated through biotin detection. These experiments confirmed the proper functioning of the generated constructs, which gave the green light to the stable transformation phase and the subsequent detection of biotinylated proteins by TurboID.
En condiciones de alta densidad vegetal, las plantas detectan cambios en la calidad de la luz que reciben y activan un sistema llamado "síndrome de huida de la sombra", que implica una serie de cambios en su desarrollo para competir por la luz con las plantas vecinas y evitar que estas proyecten sombra sobre ellas. Este mecanismo está regulado por un gran número y variedad de proteínas, como el factor de transcripción PIF7 y la proteína remodeladora de la cromatina LHP1, las cuales se ha demostrado que desempeñan un papel crucial en la regulación del síndrome de huida de la sombra. Este trabajo se enfoca en la preparación de la técnica TurboID, que permite analizar las interacciones proteína-proteína para comprender mejor los mecanismos a través de los cuales estas proteínas regulan la expresión génica durante la respuesta a la sombra. Para llevar a esto cabo, es necesario fusionar la proteína TurboID (una biotina ligasa) con las proteínas LHP1 y PIF7 mediante clonación. A partir de les fusiones proteicas LHP1-TurboID y PIF7-TurboID a las que llamamos construcciones, se realizó una transformación transitoria de la planta de tabaco Nicotiana benthamiana. Posteriormente, se analizó in vivo la expresión génica mediante el análisis de RNA y la presencia de las proteínas fusionadas mediante Western Blot y microscopía confocal. Finalmente, se evaluó la actividad de la biotina ligasa de las proteínas fusionadas mediante la detección de la biotina. Estos experimentos permitieron confirmar el correcto funcionamiento de las construcciones generadas, lo que dio luz verde al posterior análisis de transformación estable y a la detección de proteínas biotiniladas por la TurboID.
En condicions d’alta densitat vegetal, les plantes detecten canvis en la qualitat de la llum que reben i activen un sistema anomenat ‘síndrome de fugida de l’ombra’, un conjunt de canvis en el desenvolupament per competir per la llum amb les plantes veïnes i evitar que aquestes projectin ombra sobre seu. Aquest mecanisme està regulat per un gran nombre i varietat de proteïnes, com per exemple el factor de transcripció PIF7 i la proteïna remodeladora de la cromatina LHP1, les quals s’ha demostrat que tenen un paper crucial en la regulació de la síndrome de fugida de l’ombra. Aquest treball se centra en la preparació de la tècnica TurboID, que permet analitzar les interaccions proteïna-proteïna per tal d’entendre millor els mecanismes pels quals aquestes proteïnes regulen l’expressió gènica durant la resposta a ombra. Per fer-ho, és necessari fusionar la proteïna TurboID (una biotina lligasa) a les proteïnes LHP1 i PIF7 mitjançant una clonació. A partir de les fusions proteiques LHP1-TurboID i PIF7-TurboID(a les que anomenem construccions), s’ha realitzat una transformació transitòria de la planta de tabac Nicotiana benthamiana. Posteriorment, s’ha analitzat in vivo l’expressió gènica mitjançant anàlisi de RNA, així com i la presència de les proteïnes fusionades a través de Western Blot i mitjançant microscòpia confocal. Finalment, s’ha analitzat l’activitat biotina lligasa de les proteïnes de fusió a través de detecció de biotina. Aquests experiments han permès comprovar el correcte funcionament de les construccions generades, el que dona llum verda a posteriors anàlisis de transformació estable i de detecció de proteïnes biotinilades per la TurboID.
gmail.com
