Caracterització dels mecanismes moleculars implicats en la proteòlisi de l’enzim activador de SUMO (E1)

Abstract

SUMOylation is a post-translational modification that modulates different processes mainly localized in the cell nucleus and that are essential in plants, such as development and responses to abiotic and biotic stresses. Despite its relevance, the processes that regulate SUMOylation are, nowadays, poorly understood. In this study, we have characterized the molecular mechanisms involved in the proteolysis of the Carboxy-terminal domain of the large subunit (SAE2) of the SUMO-activating enzyme (E1) of Arabidopsis thaliana. This processing causes a modification in the subcellular localization of the target protein, which goes from having a completely nuclear location to being distributed between the nucleus and the cytosol. Therefore, the protein HYDROLASE, which belongs to the ¿/ß-Hydrolase superfamily, has been analyzed as the main candidate protease, based on two complementary approaches. In the first, Förster Resonance Energy Transfer (FRET) technology was used, where two control proteins, synthesized in the laboratory, were used to validate the correct functioning of this methodology and to monitor its procedure. In the second, loss-of-function HYDROLASE mutant plants were used to study the mechanisms of proteolysis in vivo. With this work, the fundamental requirements to guarantee the proteolytic efficiency of the control proteins used in the FRET assay have been established and a steric hindrance has been identified in one of them, causing a functional defect during while performing the technique. In addition, it has been shown that the proteolytic reaction occurs in wild-type and mutant A.thaliana individuals for the HYDROLASE coding gene, suggesting that this protein is not involved in SAE2 processing. The present work shows that there is still a long way to understand the regulatory processes of SUMOylation in vivo and opens a door to the study of cellular implications in the shifting of the SUMO machinery to the cytosol.

La SUMOilación es una modificación postraduccional que modula diferentes procesos locali-zados, principalmente, al núcleo celular y que son esenciales en plantas, como por ejemplo el desarrollo y las respuestas a estrés abiótico y biótico. A pesar de su relevancia, los procesos que regulan la SUMOilació son, hoy en día, muy poco conocidos. En este estudio se han caracterizado los mecanismos moleculares implicados en la proteólisis del dominio Carboxi-terminal de la subunidad grande (SAE2) de la enzima activadora de SUMO (E1) de Arabidopsis thaliana. Este procesamiento, provoca una modificación en la localización subcelular de la proteína diana, la cual pasa de tener una ubicación completamente nuclear a estar repartida entre el núcleo y el citosol. Para ello, se ha analizado la proteína HIDROLASA, la cual pertenece a la superfamilia de las ¿/ß-Hidrolasas, como principal proteasa candidata, a partir de dos aproximaciones complementarias. En la primera, se ha empleado la tecnología FRET, del inglés Förster Resonance Energy Trans-fer, donde se utilizaron dos proteínas control, sintetizadas en el laboratorio, para validar el correcto funciona-mente de esta metodología y monitorizar el procedimiento. En la segunda, se han usado plantas mutantes de pérdida de función de la HIDROLASA, con el fin de estudiar los mecanismos de la proteólisis in vivo. Con este trabajo se han establecido los requisitos fundamentales para garantizar la eficiencia proteolítica de las proteínas control utilizadas en el ensayo FRET y se ha identificado un impedi-mento estérico en una de ellas que provoca un defecto funcional durante la realización técnica. Además, se ha evidenciado que en individuos de A.thaliana silvestres y mutantes por el gen codificante de la HIDROLASA se produce la reacción proteolítica, lo cual sugiere que esta proteína no está implicada en el procesamiento de SAE2. El presente trabajo pone de manifiesto que aún queda un largo camino en cuanto a la com-prensión de los procesos reguladores de la SUMOilació in vivo y abre las puertas al estudio de las implicaciones celulares que comportan el desplazamiento de la maquinaria de SUMO hacia el citosol.

La SUMOilació és una modificació post-traduccional que modula diferents processos localitzats, principalment, al nucli cel•lular i que són essencials en plantes, com ara el desenvolupament i les respostes a estrès abiòtic i biòtic. Malgrat la seva rellevància, els processos que regulen la SUMOilació són, avui en dia, molt poc coneguts. En aquest estudi s’han caracteritzat els mecanismes moleculars implicats en la proteòlisi del domini Carboxi-terminal de la subunitat gran (SAE2) de l’enzim activador de SUMO (E1) d’Arabidopsis thaliana. Aquest processament, provoca una modificació en la localització sub-cel•lular de la proteïna diana, la qual passa de tenir una ubicació totalment nuclear a estar repartida entre el nucli i el citosol. Per fer-ho, s’ha analitzat la proteïna HIDROLASA, la qual pertany a la superfamília de les ‘/ß-Hidrolases, com a principal proteasa candidata, a partir de dues aproximacions complementàries. En la primera, s’ha emprat la tecnologia FRET, de l’anglès Förster Resonance Energy Transfer, on s’utilitzaren dues proteïnes control, sintetitzades al laboratori, per validar el correcte funcionament d’aquesta metodologia i monitoritzar-ne el procediment. En la segona, s’han usat plantes mutants de pèrdua de funció de la HIDROLASA, amb la finalitat d’estudiar els mecanismes de la proteòlisi in vivo. Amb aquest treball s’han establert els requisits fonamentals per tal de garantir l’eficiència proteolítica de les proteïnes control utilitzades en l’assaig FRET i s’ha identificat un impediment estèric en una d’elles que provoca un defecte funcional durant la realització tècnica. A més, s’ha evidenciat que en individus d’A.thaliana silvestres i mutants pel gen codificant de la HIDROLASA es produeix la reacció proteolítica, cosa que suggereix que aquesta proteïna no està implicada en el processament de SAE2. El present treball posa de manifest que encara queda un llarg camí quant a la comprensió dels processos reguladors de la SUMOilació in vivo i obre les portes a l’estudi de les implicacions cel•lulars que comporten el desplaçament de la maquinària de SUMO cap al citosol.