Development of microscopic techniques for the visualization of root-knot nematode infection
Visualitza/Obre
memoria.pdf (3,777Mb) (Accés restringit)
Estadístiques de LA Referencia / Recolecta
Inclou dades d'ús des de 2022
Cita com:
hdl:2117/351177
Tipus de documentProjecte Final de Màster Oficial
Data2021-09-03
Condicions d'accésAccés restringit per decisió de l'autor
Tots els drets reservats. Aquesta obra està protegida pels drets de propietat intel·lectual i
industrial corresponents. Sense perjudici de les exempcions legals existents, queda prohibida la seva
reproducció, distribució, comunicació pública o transformació sense l'autorització del titular dels drets
Abstract
Plant-parasitic nematodes are a significant cause of yield losses and food security issues. Specifically, nematodes of the genus Meloidogyne can cause significant production losses in horticultural crops around the world. Therefore, understanding the mechanisms of the ever-changing physiology of plant roots by imaging the galls induced by nematodes could provide a great insight into this. However, infected roots are unsuitable for light microscopy investigation due to the opacity of plant tissues. Thus, samples must be cleared to visualize the interior of whole plants in order to make them transparent using clearing agents. Once cleared, there are several microscopy techniques for 3D imaging of thick biological samples. For many years, the gold standard of 3D microscopy has been confocal microscopy, however, it produces bleaching and ends up photodamaging the samples. For that reason, the purpose of this document is to assess possible alternatives for 3D imaging, such as light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) and optical projection tomography (OPT). LSFM consists of a light sheet generated by a laser while the specimen is scanned by moving the specimen in relation to a static light sheet to produce optical sections through the sample. Instead, OPT consists of acquiring a series of 2D projections from different angles, and then the 3D structure is generated as a stack of cross-sectional image slices using a reconstruction algorithm. The main objective of this project is to find out which microscopy system is the most appropriate to obtain 3D images of samples infected with Meloidogyne incognita to visualize and study the root-nematode interaction. In addition to fine-tuning clarification protocols to facilitate deep-tissue imaging of intact roots plants in order to visualize the degree of RKN infection. The samples provided for this study were tomato cv. Durinta and eggplant cv. Cristal inoculated with Meloidogyne incognita. To determine whether reducing differences in refractive indices within the tissue and removing coloured tissue components improves the optical transparency of biological samples, the clearing solutions tested have been BABB, ECi, and TDE. The effect of different dehydration solvents (ethanol, methanol, and 1-propanol) has also been investigated. In addition, the advantages and disadvantages of alternative microscopic techniques to confocal have been analysed employing an experimental setup that combines three microscopic techniques (LSFM, brightfield OPT, and fluorescence OPT) has been employed. On one hand, the results show that the proposed protocol that uses 1-propanol as a dehydration agent and ECi as a RI-matching reagent is the most suitable for imaging tomato roots. However, for imaging eggplant roots, the most favourable combination is ethanol-BABB. On the other hand, imaging results show that both microscopy techniques (LSFM and OPT) enable the observation of roots infected with M. incognita. However, LSFM is preferred for higher resolution images, while OPT is suitable for faster acquisition as a complementary technique. Els nematodes paràsits de les plantes són una causa important de pèrdues de rendiment i de problemes en la seguretat alimentària. Més concretament, els nematodes del gènere Meloidogyne poden provocar pèrdues importants en la producció de cultius hortícoles de tot el món. Per tant, entendre els mecanismes de la fisiologia canviant de les arrels de les plantes mitjançant l¿obtenció d¿imatge de les agalles induïdes pels nematodes podria proporcionar una gran visió del problema. Tot i això, les arrels infectades no són adequades per a la investigació en microscòpia òptica a causa de l'opacitat dels teixits vegetals. Per això, és necessari clarificar les mostres mitjançant agents de clarificació per tal de fer-les transparents i poder visualitzar l'interior de plantes senceres. Un cop clarificades, existeixen diverses tècniques de microscòpia per a l¿obtenció d¿imatge en 3D de mostres biològiques gruixudes. Durant molts anys, la tècnica estàndard en la microscòpia en 3D ha estat la microscòpia confocal, però aquesta produeix blanqueig i acaba foto-danyant les mostres. Per aquest motiu, el propòsit d'aquest treball és avaluar possibles alternatives per a l¿obtenció d'imatges en 3D, com la microscòpia de fluorescència de fulla de llum (LSFM) i la tomografia de projecció òptica (OPT). La LSFM consisteix en una làmina de llum estàtica generada per un làser mentre la mostra s'escaneja movent-la en relació amb la làmina de llum per produir seccions òptiques a través de la mostra. En canvi, l¿OPT consisteix a adquirir una sèrie de projeccions 2D des de diferents angles, per després generar l¿estructura en 3D amb un algoritme de reconstrucció com una pila de talls d'imatges en secció transversal. L'objectiu principal d'aquest projecte és determinar quin sistema de microscòpia és el més adequat per obtenir imatges en 3D de mostres infectades amb Meloidogyne incognita per poder visualitzar i estudiar la interacció arrel-nematode. A més d¿afinar els protocols de clarificació per facilitar l¿obtenció d¿imatges de teixits d¿arrels intactes i visualitzar el grau d'infecció de nematodes paràsits de les plantes. Les mostres proporcionades per a aquest estudi van ser tomàquet cv. Durinta i albergínia cv. Cristal inoculades amb Meloidogyne incognita. Per tal de determinar si reduir les diferències dels índexs de refracció i eliminar components pigmentats del teixit millora la transparència òptica de les mostres biològiques, s¿han estudiat les següents solucions de clarificació: BABB, ECi i TDE. També s'ha investigat l'efecte de diferents dissolvents de deshidratació: etanol, metanol i 1-propanol. A més a més, s'ha analitzat els avantatges i desavantatges de les tècniques microscòpiques alternatives a la microscòpia confocal emprant una configuració experimental que combina tres tècniques microscòpiques: LSFM, OPT de camp clar i OPT de fluorescència. D'una banda, els resultats mostren que el protocol que utilitza 1-propanol com a agent de deshidratació i ECi com a reactiu clarificant és el més adequat per a l¿obtenció d'imatges d'arrels de tomàquet. Tot i això, per a l¿obtenció d'imatges d'arrels d'albergínia, la combinació més favorable és etanol-BABB. D'altra banda, els resultats mostren que les dues tècniques de microscòpia (LSFM i OPT) permeten l'observació d'arrels infectades amb M. incognita. No obstant això, LSFM és preferible per a l¿adquisició d¿imatges amb una major resolució, mentre que OPT és adequat com a tècnica complementària per a una adquisició més ràpida. Los nematodos parásitos de las plantas son una causa importante de pérdidas de rendimiento y de problemas en la seguridad alimentaria. Más concretamente, los nematodos del género Meloidogyne pueden provocar pérdidas importantes en la producción de cultivos hortícolas de todo el mundo. Por lo tanto, entender los mecanismos de la fisiología cambiante de las raíces de las plantas mediante la obtención de imagen de las agallas inducidas por los nematodos podría proporcionar una gran visión del problema. Sin embargo, las raíces infectadas no son adecuadas para la investigación en microscopía óptica debido a la opacidad de los tejidos vegetales. Por ello, es necesario clarificar las muestras mediante agentes de clarificación a fin de hacerlas transparentes y poder visualizar el interior de plantas enteras. Una vez clarificadas, existen diversas técnicas de microscopía para la obtención de imagen en 3D de muestras biológicas gruesas. Durante muchos años, la técnica estándar en la microscopía en 3D ha sido la microscopía confocal, pero esta produce blanqueo y termina foto-dañando las muestras. Por este motivo, el propósito de este trabajo es evaluar posibles alternativas para la obtención de imágenes en 3D, como la microscopía de fluorescencia de hoja de luz (LSFM) y la tomografía de proyección óptica (OPT). La LSFM consiste en una lámina de luz estática generada por un láser mientras la muestra se escanea moviéndola en relación con la lámina de luz para producir secciones ópticas a través de la muestra. En cambio, la OPT consiste en adquirir una serie de proyecciones 2D desde diferentes ángulos, para después generar la estructura en 3D con un algoritmo de reconstrucción como una pila de cortes de imágenes en sección transversal. El objetivo principal de este proyecto es determinar qué sistema de microscopía es el más adecuado para obtener imágenes en 3D de muestras infectadas con Meloidogyne incognita para poder visualizar y estudiar la interacción raíz-nematodo. Además de afinar los protocolos de clarificación para facilitar la obtención de imágenes de tejidos de raíces intactas y visualizar el grado de infección de nematodos parásitos de plantas. Las muestras proporcionadas para este estudio fueron tomate cv. Durinta y berenjena cv. Cristal inoculadas con Meloidogyne incognita. Con el fin de determinar si reducir las diferencias de los índices de refracción y eliminar componentes pigmentados del tejido mejora la transparencia óptica de las muestras biológicas, se han estudiado las siguientes soluciones de clarificación: BABB, ECi y TDE. También se ha investigado el efecto de diferentes disolventes de deshidratación: etanol, metanol y 1-propanol. Además, se han analizado las ventajas y desventajas de las técnicas microscópicas alternativas a la microscopía confocal utilizando una configuración experimental que combina tres técnicas microscópicas: LSFM, OPT de campo claro y OPT de fluorescencia. Por un lado, los resultados muestran que el protocolo que utiliza 1-propanol como agente de deshidratación y ECi como reactivo para clarificar es el más adecuado para la obtención de imágenes de raíces de tomate. Sin embargo, para la obtención de imágenes de raíces de berenjena, la combinación más favorable es etanol-BABB. Por otra parte, los resultados muestran que ambas técnicas de microscopía (LSFM y OPT) permiten la observación de raíces infectadas con M. incognita. Sin embargo, LSFM es preferible para la adquisición de imágenes con una resolución mayor, mientras que OPT es adecuado como técnica complementaria para una adquisición más rápida.
Fitxers | Descripció | Mida | Format | Visualitza |
---|---|---|---|---|
memoria.pdf | 3,777Mb | Accés restringit |