Research and validation of a molecular tracer to study the effect of cold atmospheric plasma on alginate solutions

Abstract

En los últimos años ha cobrado importancia el uso de los plasmas atmosféricos fríos en aplicaciones biomédicas, ya que que ofrecen la posibilidad de tratar tejidos vivos debido a su baja temperatura de tratamiento, y las especies reactivas que producen al tratar líquidos permiten una acción terapéutica similar en tejidos vivos. Investigaciones recientes han demostrado que el tratamiento con plasma tiene diversas aplicaciones de interés (ayuda a la cicatrización de heridas, esterilización de dispositivos médicos, etc..) El grupo de Medicina Plasma del BBT (UPC) utiliza esta tecnología para estudiar un posible tratamiento para el osteosarcoma, en combinación con hidrogeles de biopolímeros dentro del proyecto APACHE (Atmospheric Pressure plasma meets biomaterials for bone Cancer Healing) financiado por el Consejo Europeo de Investigación (ERC). Los biopolímeros están emergiendo como materiales adecuados para muchas aplicaciones en medicina, debido a su versatilidad y biocompatibilidad. El tratamiento con plasma de hidrogeles es muy novedoso, y se ha visto que puede producir una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno que pueden almacenarse de manera efectiva y liberarse al entorno biológico. Se ha demostrado que estas especies matan selectivamente las células cancerosas si se dosifican adecuadamente, pero se desconoce aun cómo se modifica el polímero por efecto del tratamiento de plasma y que repercusiones puede tener esto. El objetivo de este Proyecto Final de Grado es doble: por una parte explorar la literatura con el fin de encontrar posibles estrategias para abordar el efecto del tratamiento con plasmas fríos en soluciones de alginato, a nivel molecular, que dependen del uso de moléculas trazadoras; para descubrir cómo otros grupos usaron moléculas trazadoras para estudiar los efectos de los plasmas fríos en un sistema más complejo e identificar las características de una buena molécula trazadora. Por otra parte, en la segunda parte del proyecto, aplicamos este conocimiento para diseñar y validar un posible modelo para alginato. En la primera parte, recopilamos varios estudios, centrados en evaluar los efectos del plasma frío en las moléculas trazadoras más relevantes (fenol, cisteína y glutatión). Al identificar la oxidación de estas moléculas es posible extrapolar los resultados a sistemas más complejos y encontrar correlaciones entre las fuentes y parámetros del plasma, la producción de RONS y los resultados biológicos.En la segunda parte, identificamos el glucoronato como posible modelo para el alginato y lo investigamos experimentalmente en términos de producción de especies reactivas mediante tratamiento con plasma. Cuantificamos las especies reactivas (peróxido de hidrógeno, iones nitrito y radicales OH) producidas en soluciones de alginato y glucoronato utilizando sondas químicas colorimétricas y fluorescentes y las comparamos con la cantidad producida en el tampón fosfato. Descubrimos que la cantidad de especies reactivas producidas en soluciones de alginato y glucoronato con la misma concentración es la misma, lo que significa que el glucoronato es un buen modelo a nivel molecular. Además, confirmamos que la cantidad de peróxido de hidrógeno y nitritos producidos es mayor que en el tampón fosfato, mientras que la cantidad de radicales hidroxilo es menor, lo que significa que algunos de ellos están reaccionando con la materia orgánica presente en la solución. También comenzamos algunos experimentos preliminares para evaluar el efecto del tratamiento con plasma sobre soluciones de alginato y glucoronato mediante espectroscopía infrarroja y para mapear la generación y difusión de especies reactivas en soluciones usando una sonda colorimétrica.

In the last years the importance of cold atmospheric plasma has grown in many fields and especially in medicine because of its versatility in terms of production of reactive species, low power delivered to the target, possibility of direct or indirect treatment and low cost. Recent studies highlighted the many advantages of cold plasmas in different applications, namely sterilization, wound healing, or cancer treatment. The Plasma Medicine group of BBT at UPC uses this technology to study a possible treatment to osteosarcoma, in combination with hydrogel biopolymers within the project APACHE (Atmospheric Pressure plasma meets biomaterials for bone Cancer Healing) funded by European Research Council (ERC). Biopolymers are emerging as materials suitable for many applications in medicine, due to their versatility, biocompatibility and low density. Plasma treatment of hydrogels produces high amount of reactive oxygen and nitrogen species that can be effectively stored and delivered to the target. These species have been proven to selectively kill cancer cells if properly dosed. Plasma treatment of alginate has been studied recently and the polymer has proven to be a good substrate for high generation of reactive species and their storage in time. The chemical mechanisms responsible to these effects are still under study, but it is not an easy task due to the high complexity of the system and the impossibility to apply the most common analytical techniques to polymer solutions. A possible strategy to overcome this issue is to find a molecular model that is chemically similar to alginate and to study the effects of cold plasma on it. The aim of this final degree project is to scout the literature in order to find possible strategies to tackle the aforementioned issue (study the effect of cold plasma treatment on alginate solutions on a molecular level) that rely on the use of tracer molecules; to find how other groups used tracer molecules to study the effects of cold plasmas on more complex system and to identify the characteristics of a good tracer molecule. In the second part of the project, we apply this knowledge to design and validate a possible model for alginate. In the first part we summarize and review various studies, focused on evaluating the effects of cold plasma on the most relevant tracer molecules (phenol, cysteine and glutathione). By identifying the oxidation of these molecules is possible to extrapolate the results to more complex systems and to find correlations between plasma sources and parameters, production of RONS and biological outcomes. In the second part, we identified glucuronate as possible model for alginate and we tested it in terms of production of reactive species by plasma treatment. We quantified reactive species (hydrogen peroxide, nitrite ions and hydroxyl radicals) produced in alginate and glucoronate solutions using colorimetric and fluorescent chemical probes and we compared them with the amount produced in phosphate buffer. We found that the amount of reactive species produced in alginate and glucuronate solutions with same concentration is the same, meaning that glucoronate is a good model on a molecular level. Moreover, we confirmed that the amount of hydrogen peroxide and nitrites produced is higher than in phosphate buffer, while the amount of OH radicals is lower, meaning that some of them are reacting with the organic matter present in solution. We started also some preliminary experiments to assess the effect of plasma treatment on alginate and glucuronate solutions by infrared spectroscopy and to map the generation and diffusion of reactive species in solutions using a colorimetric probe.

En els últims anys ha cobrat importància l'ús dels plasmes atmosfèrics freds en aplicacions biomèdiques, ja que que ofereixen la possibilitat de tractar teixits vius per la seva baixa temperatura de tractament, i les espècies reactives que produeixen a l'tractar líquids permeten una acció terapèutica similar en teixits vius. Investigacions recents han demostrat que el tractament amb plasma té diverses aplicacions d'interès (esterilització de dispositius mèdics, curació de ferides, tractament de cancer) El grup de Medicina Plasma del BBT (UPC) utilitza aquesta tecnologia per estudiar un possible tractament per l'osteosarcoma, en combinació amb hidrogels de biopolímers dins el projecte APACHE (Atmospheric Pressure plasma meets biomaterials for bone Cancer Healing) finançat pel Consell Europeu de Recerca (ERC). Els biopolímers estan emergint com materials adequats per a moltes aplicacions en medicina, per la seva versatilitat i biocompatibilitat. El tractament amb plasma d'hidrogels és molt novedos, i s'ha vist que pot produir una gran quantitat d'espècies reactives d'oxigen i nitrogen que poden emmagatzemar-se de manera efectiva i alliberar-se a l'entorn biològic. S'ha demostrat que aquestes espècies maten selectivament les cèl·lules canceroses si es dosifiquen adequadament, però es desconeix encara com es modifica el polímer per efecte de l'tractament de plasma i quines repercussions pot tenir això. L'objectiu d'aquest projecte de grau final és doble: d'una banda explorar la literatura per tal de trobar possibles estratègies per abordar l'efecte de l'tractament amb plasma fred a les solucions d'alginat a nivell molecular que depenen de l'ús de molècules traçadores; descobrir com altres grups han emprat molècules traçadores per estudiar els efectes dels plasmes freds en un sistema més complex i identificar les característiques d'una bona molècula traçadora. D'altra banda, en la segona part del projecte, apliquem aquest coneixement per a dissenyar i validar un possible model per alginat. A la primera part, recopilem diversos estudis, centrats en avaluar els efectes de l'plasma fred a les molècules traçadores més rellevants (fenol, cisteïna i glutatió). A l'identificar l'oxidació d'aquestes molècules és possible extrapolar els resultats a sistemes més complexos i trobar correlacions entre les fonts i paràmetres del plasma, la producció de RONS i els resultats biològics. A la segona part, identifiquem el glucoronat com a possible model per l'alginat i l’investiguem experimentalment en termes de producció d'espècies reactives mitjançant tractament amb plasma. Quantifiquem les espècies reactives (peròxid d'hidrogen, ions nitrit i radicals OH) produïdes en solucions d'alginat i glucoronat utilitzant sondes químiques colorimètriques i fluorescents i les comparem amb la quantitat produïda en el tampó fosfat. Vam descobrir que la quantitat d'espècies reactives produïdes en solucions d'alginat i glucoronat amb la mateixa concentració és la mateixa, el que significa que el glucoronat és un bon model a nivell molecular. A més, confirmem que la quantitat de peròxid d'hidrogen i nitrits produïts és més gran que en el tampó fosfat, mentre que la quantitat de radicals hidroxil és menor, el que significa que alguns d'ells estan reaccionant amb la matèria orgànica present en la solució. També vam començar alguns experiments preliminars per avaluar l'efecte de l'tractament amb plasma sobre solucions d'alginat i glucoronat mitjançant espectroscòpia infraroja i per mapejar la generació i difusió d'espècies reactives en solucions usant una sonda colorimètrica.