Optimització de tècniques bioquímiques per a la determinació d'espècies de Meloidogyne spp.

Abstract

The root-knot nematodes belonging to the genus Meloidogyne are obligated plant endoparasitic organisms worldwide distributed and able to parasitize more than 2000 plant species, including the majority of crops. This genus contains more than 100 species, of which M. arenaria, M. incognita and M. javanica are the most frequent. The identification of root-knot nematode species is done using morphometric characteristics, DNA profiles or isoenzymes phenotypes. The isoenzymes used for diagnostics include the esterases. The identification by the esterase phenotypes in native conditions requires of the relative migration of them and the pattern phenotype of M. javanica in order to estimate the relative esterase positions of the other species. In order to overcome the dependence of the pattern phenotype by establishing the molecular weight of esterases of the three species of Meloidogyne more worldwide distributed, several tests were made in order to use this biochemical technique for be used as a diagnostic tool. Therefore, the objective of this work was to determine the molecular weight of the esterases phenotypes of M. arenaria, M. incognita and M. javanica using zymograms in semi-native conditions. Females of different populations of Meloidogyne spp. were used as substrate. The root-knot nematode species were identified by the polymerase chain reaction (PCR) with SCAR and the esterase phenotype in native conditions. Afterwards, the esterases phenotypes were obtained under semi-native conditions, after extracting the proteins and separating them using SDS-PAGE electrophoresis and the incubation with Naphtyl as an esterase substrate. The results showed a phenotype with 6 bands of 40, 45, 50, 60, 85 and 120 kDa for M. javanica, a phenotype with 2 bands of 68 and 120 kDa for M. incognita and a phenotype of 3 bands of 45, 68 and 120 kDa, and, in some cases of 68, 90 and 120 kDa for M. arenaria.

Els nematodes fito-paràsits formadors d'agalles pertanyents al gènere Meloidogyne són organismes endoparàsits sedentaris obligats, es troben distribuïts per tot el món i poden parasitar més de 2000 espècies vegetals, incloent-hi la majoria de cultius. Aquest gènere conté més de 100 espècies, de les quals M. arenaria, M. incognita i M. javanica són les més freqüents. La identificació de les espècies és fa en base a característiques morfomètriques, perfils d'ADN o fenotips d'isoenzims. Entre els isoenzims utilitzats per diagnòstic es troben les esterases. La identificació segons el fenotip d'esterases es fa en condicions natives i requereix de la migració relativa de les mateixes per a poder discriminar entre espècies i del fenotip patró de M. javanica per a poder estimar la posició relativa de la resta d'espècies. Per tal d'eliminar la dependència del fenotip patró i establir el pes molecular de les esterases de les tres espècies de Meloidogyne més àmpliament distribuïdes arreu del món, es van realitzar una sèrie de proves per a utilitzar aquesta tècnica bioquímica amb la finalitat de diagnòstic. Així doncs, l'objectiu d'aquest treball va ser determinar el pes molecular de les esterases de M. arenaria, M. incognita i M. javanica mitjançant zimogrames en condicions semi natives. Es van utilitzar femelles de diferents poblacions de Meloidogyne spp. com a substrat, i es van identificar les espècies mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) amb SCAR i el fenotip d'esterases en condicions natives. Posteriorment, es van obtenir els fenotips d'esterases en condicions semi natives, després d'extreure les proteïnes i separar-les mitjançant electroforesi SDS-PAGE i incubació amb Naphtyl com a substrat d'esterases. Els resultats obtinguts van permetre determinar un fenotip de 6 bandes de 40, 45, 50, 60, 85 i 120 kDa per M. javanica, un fenotip de 2 bandes de 68 i 120 kDa per M. incognita i 3 bandes de 45, 68 i 120 kDa, i , en alguns casos de 68, 90 i 120 kDa per M. arenaria.

Los nematodos fitoparásitos formadores de agallas pertenecientes al género Meloidogyne son organismos endoparásitos sedentarios obligados, se encuentran distribuidos por todo el mundo y pueden parasitar más de 2000 especies vegetales, incluyendo la mayoría de cultivos. Este género contiene más de 100 especies, de las cuales M. arenaria, M. incognita y M. javanica son las más frecuentes. La identificación de las especies se realiza en base a características morfométricas, perfiles de ADN o fenotipos de isoenzimas. Entre las isoenzimas utilizadas para diagnóstico se encuentran las esterasas. La identificación mediante el fenotipo de esterasas se realiza en condiciones nativas y requiere de la migración relativa de las mismas para poder discriminar entre especies y del fenotipo patrón de M. javanica para poder estimar la posición relativa del resto de especies. Para eliminar la dependencia del fenotipo patrón y establecer el peso molecular de las esterasas de las tres especies de Meloidogyne más ampliamente distribuidas a nivel mundial, se realizaron una serie de pruebas para utilizar esta técnica bioquímica con la finalidad de diagnóstico. Por ello, el objetivo de este trabajo fue determinar el peso molecular de las esterasas de M. arenaria, M. incognita y M. javanica mediante zimogramas en condiciones semi-nativas. Se utilizaron hembras de diferentes poblaciones de Meloidogyne spp. como sustrato, y se identificaron las especies mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con SCAR y el fenotipo de esterasas en condiciones nativas. Posteriormente, se obtuvo el fenotipo de esterasas en condiciones semi-nativas, después de extraer las proteínas y separarlas mediante electroforesis SDS-PAGE e incubación con Naphtyl como substrato de esterasas. Los resultados obtenidos permitieron determinar un fenotipo de 6 bandas de 40, 45, 50, 60, 85 y 120 kDa para M. javanica, un fenotipo de 2 bandas de 68 y 120 kDa para M. incognita y 3 bandas de 45, 68 y 120 kDa, y, en algunos casos de 68, 90 y 120 kDa para M. arenaria.