Desenvolupament de mètodes experimentals de cultius d’amastigots de Leishmania spp. per millorar la quantificació dels resultats experimentals

Abstract

Leishmaniases are a group of diseases that cause thousands of deaths every year in the Southcountries. These diseases are caused by a protozoa of the genus Leishmania spp., which develops its life cycle between a vertebrate host and an the invertebrate vector through which they are transmitted (sand flies). Leishmania spp. belongs to the Trypanosomatidae family, which also includes species of the genus Trypanosoma. It causes the different forms of tripanosomiasis, known as Chagas disease in America and sleeping illness in Africa. Both of them are considered by the World Health Organization (WHO) as one of the 17 Neglected Tropical Diseases. The purpose of this work is to go further and deeper in the quantification methods of the experimental results from in vitro cultures of Leishmania spp. amastigotes (i.e., the intracellular form of the vertebrate stage). The experimental work has been done in the Parasitology Section of the Department of Health Microbiology and Parasitology of the Faculty of Pharmacy (University of Barcelona). Several assays were carried out, in which macrophages collected from murine animals and from the cell line RAW264.7 were infected with promastigotes (extracellular form of the vector stage) of different species of Leishmania (L. infantum, L. major and L. braziliensis). Different observations on the procedures of collecting murine cells, maintaining and monitoring the cultures were pointed. A common time pattern was established for both types of macrophages. The identification of intermediate forms (promastigotes changing into amastigotes) and the time when amastigotes number reached its maximum peak (72 h) were set up. The digitalization of the slides from the cultures was done at Barcelona School of Agricultural Engineering (ESAB). More than 700 images were collected. In order to allow for a better understanding the images were captured with 20 and 50 magnification objectives lens. The use of several experimental procedures allowed to analyse the differences between them and to improve the methodology. An experimental protocol for the cultures and their digitalization was proposed to have a better processing of the obtained information. The need for improving the experimental protocols and developing an image analysis technique to process the information obtained from them were shown, in order to have a better understanding of the parasite. At the same time, it is necessary to work on an Individual based Model (IbM) in order to introduce the system complexity at an individual level.

La leishmaniosi engloba un conjunt de malalties que causen milers de morts anualment als països del Sud. Aquesta està causada per protozous del gènere Leishmania spp., que desenvolupen el seu cicle de vida entre un hoste vertebrat i un vector invertebrat mitjançant el qual es transmeten (flebòtoms, família Phlebotominae). Leishmania spp. pertany a la família Trypanosomatidae, en la que també s'inclouen les espècies del gènere Trypanosoma responsables de les diferents formes de tripanosomiasis, coneguda com la malaltia de Chagas al continent Americà i com la malaltia de la son al continent Africà. Totes elles formen part de les 17 malalties tropicals que la Organització Mundial de la Salut (OMS) identifica com a desateses. L'objectiu principal d'aquest Treball Final de Grau és avançar en les metodologies de quantificació dels resultats experimentals procedents dels cultius in vitro d'amastigots de Leishmania spp. (forma intracel·lular, pròpia de l'hoste vertebrat). El treball experimental s'ha realitzat sota la direcció de la Secció de Parasitologia del Departament de Biologia, Sanitat i Medi Ambient a la Facultat de Farmàcia i Ciències de l'Alimentació (Universitat de Barcelona). S'han dut a terme diferents assajos en els que s'han infectat macròfags d'origen peritoneal murí i de línia cel·lular RAW 264.7 amb promastigots (forma extracel·lular, pròpia de l'hoste invertebrat) de diferents espècies del gènere Leishmania (L. infantum, L. major i L. braziliensis). Al llarg dels assajos s'han realitzat observacions sobre els procediments utilitzats per l'obtenció de les cèl·lules d'origen peritoneal murí, la infecció i el manteniment dels cultius. A partir del seu seguiment s'ha pogut establir un patró temporal comú independentment del tipus de macròfags infectats, en el que s'han identificat formes intermèdies extracel·lulars(promastigots que varien la seva morfologia cap a amastigots) i s'ha pogut determinar que el nombre d'amastigots és màxim a les 72 hores. La digitalització de les preparacions procedents dels cultius s'ha realitzat a l'Escola Superior d'Agricultura de Barcelona (ESAB). S'ha elaborat una col·lecció de més de 700 imatges. Aquestes s'han capturat a 20 i 50 augments per facilitar la comprensió del sistema a nivell dels macròfags i del cultiu. L'ús de diferents procediments experimentals ha permès avaluar els seus efectes i millorar la metodologia utilitzada. En aquesta línia, hem definit un protocol experimental, tan dels cultius com de la seva digitalització, amb l'objectiu de facilitar el posterior processat de la informació obtinguda. Per seguir avançant en la comprensió del paràsit, cal seguir treballant per millorar els procediments experimentals i desenvolupar una tècnica d'anàlisi d'imatges que ens permeti processar la informació que se n'obté. De manera paral·lela, cal elaborar un model basat en l'individu (Individual based Model; IbM) que ens permeti introduir la complexitat del sistema de manera gradual a nivell individual.

La leishmaniosis engloba un conjunto de enfermedades que causan miles de muertes anualmente en los países del Sud. Está causada por protozoos del género Leishmania spp., que desarrollan su ciclo de vida entre un hospedador vertebrado y un vector invertebrado mediante el que se transmiten. Leishmania spp. pertenece a la familia Trypanosomatidae, en la que también se incluyen las especies del género Trypanosoma responsables de las diferentes formas de tripanosomiasis, conocida como la enfermedad de Chagas en el continente Americano y cómo la enfermedad del sueño en el continente Africano. Todas ellas forman parte de las 17 enfermedades tropicales que la Organización Mundial de la Salud (OMS) identifica como desatendidas. El objetivo principal de este Trabajo de Fin de Grado es avanzar en las metodologías de cuantificación de los resultados experimentales procedentes de los cultivos in vitro de amastigotes de Leishmania spp. (forma intracelular, propia del hospedador vertebrado). El trabajo experimental se ha realizado bajo la dirección de la Sección de Parasitologia del Departamento de Biología, Sanidad y Medio Ambiente de la Facultad de Farmacia y Ciencias de la Alimentación (Universidad de Barcelona). Se han llevado a cabo diferentes ensayos en los que se han infectado macrófagos de origen peritoneal murino y de línea celular RAW 264.7 con promastigotes (forma extracelular, propia del hospedador invertebrado) de diferentes especies de Leishmania spp. (L. infantum, L. major y L.braziliensis). En el transcurso de los ensayos se han realizado observaciones sobre los procedimientos utilizados para la obtención de células de origen peritoneal murino, la infección y el mantenimiento de los cultivos. A partir de su observación se ha podido establecer un patrón temporal común independientemente del tipo de macrófago utilizado, en el que se han identificado formas intermedias extracelulares (promastigotes que varían su morfología hacia amastigotes) y se ha podido determinar que el número de amastigotes es máximo a las 72 horas. La digitalización de las preparaciones de los cultivos se ha realizado en la Escuela Superior de Agricultura de Barcelona (ESAB). Se ha elaborado una colección de más de 700 imágenes. Éstas se han capturado a 20 y 50 aumentos para facilitar la comprensión del sistema a nivel de los macrófagos y el cultivo. El uso de diferentes procedimientos experimentales ha permitido avaluar sus efectos y mejorar la metodología utilizada. En esta línea, hemos definido un protocolo experimental, no sólo de los cultivos sino que también de su digitalización, con el objetivo de facilitar el posterior procesado de la información obtenida. Para seguir avanzando en la comprensión del parásito, es necesario seguir trabajando para mejorar los procedimientos experimentales y desarrollar una técnica de análisis de imágenes que nos permita procesar la información que se obtiene de ellos. Paralelamente, es necesario elaborar un modelo basado en el individuo (Individual based Model; IbM) que nos permita introducir de manera gradual la complejidad del sistema a nivel individual.