Pèptids AT-Hook i proteïna HMGA1a(A50-91) humana. Expressió, purificació i cristal·lització amb oligonucleòtids
View/Open
Memòria (4,459Mb) (Restricted access)
Document typeMaster thesis
Date2009-09
Rights accessRestricted access - author's decision
All rights reserved. This work is protected by the corresponding intellectual and industrial
property rights. Without prejudice to any existing legal exemptions, reproduction, distribution, public
communication or transformation of this work are prohibited without permission of the copyright holder
Abstract
La proteïna HMGA1a humana és una proteïna que es troba al nucli de les cèl·lules i que pot
modificar la conformació espacial del DNA regulant l’expressió de molts gens. Se sap que la
interacció es dóna a través d’uns motius d’unió al DNA denominats AT-hooks que s’uneixen
preferentment a regions riques en ATs del solc estret del DNA. D’aquesta manera l’HMGA1a
influeix en molts processos cel·lulars normals com són el creixement cel·lular, la diferenciació
cel·lular o la reparació del DNA. D’altra banda, les proteïnes HMGA estan relacionades amb
nombrosos processos patològics, entre ells el càncer.
Per a comprendre com actua aquesta proteïna és molt important arribar a determinar l’estructura
tridimensional dels seus complexos amb el DNA. Amb aquest objectiu s'ha intentat aconseguir
complexos cristal·litzats d'aquesta proteïna o motius d'unió al DNA (pèptids AT-hook) amb
oligonucleòtids. Concretament s’ha treballat amb la forma HMGA1a(A50-91) i els pèptids
corresponents a les regions AT-hook I, II i III.
Primerament s’ha obtingut la forma HMGA1a(A50-91) amb la tècnica del DNA recombinant
mitjançant la seva expressió en un cultiu del bacteri Escherichia coli i s’ha purificat fins obtenir
una fracció prou pura i concentrada pels estudis cristal·logràfics. Les tècniques emprades han
estat la cromatografia de bescanvi iònic i la de gel filtració.
En segon lloc, s’han realitzat tot un seguit d’assajos cristal·logràfics mitjançant la tècnica de
difusió de vapor amb gota penjada:
- Proteïna HMGA1a(A50-91) amb els següents oligonucleòtids: CGCAT2A2TGCG,
A2TA2T2AT2 iCGCGAT2A2T.
- Pèptids AT-hook amb els oligonucleòtids CGCAT2A2TGCG, A2TA2T2AT2,
CGCGAT2A2T i GGGAAATTCCTC.
A partir dels vuitanta assajos realitzats, es van poder congelar vint-i-tres cristalls que van ser
analitzats per difracció de raigs X al sincrotró de Grenoble (ESRF).
Finalment, s’han obtingut els paràmetres de la cel·la unitària i el sistema cristal·lí de dos
complexos de pèptid-DNA.
DegreeMÀSTER UNIVERSITARI EN ENGINYERIA BIOTECNOLÒGICA (Pla 2009)
Collections
Files | Description | Size | Format | View |
---|---|---|---|---|
memòria-annex.pdf![]() | Memòria | 4,459Mb | Restricted access |