Expressió, purificació i assajos cristal·logràfics de la proteïna HMGA1b(1-90)

Abstract

Les proteïnes HMG (High Mobility Group) són un grup de proteïnes cromosòmiques no histones que van ser anomenades així degut a la seva mobilitat electroforètica. Aquest conjunt de proteïnes està dividit en tres grans subfamílies: les HMGA, les HMGB i les HMGN. Les proteïnes HMGA poden modificar la conformació espacial del DNA, regulant (positivament o negativament) l’expressió de nombrosos gens i influint en molts processos cel·lulars normals com ara el creixement, proliferació, diferenciació i mort cel·lular, i la reparació del DNA. També estan relacionades amb diferents processos patològics, entre ells l’obesitat, la diabetis, l’arteriosclerosi i el càncer. S’ha observat com, en molts tipus de càncers, hi ha una sobre-expressió d’aquestes proteïnes. Se sap que la interacció HMGA-DNA es dóna a través d’uns motius d’unió al DNA anomenats “AT-hooks”, els quals s’uneixen a regions riques en adenines (A) i timines (T) del DNA. En les proteïnes HMGA es troben tres motius AT-hook. Per a comprendre millor el mecanisme d’acció d’aquestes proteïnes, és important conèixer l’estructura tridimensional que formen els complexos DNA-proteïna. Amb aquesta finalitat es persegueix l’obtenció de co-cristalls de la proteïna HMGA1b(1-90) amb oligonucleòtids sintètics rics en seqüències ATs. En primer lloc, s’ha expressat la proteïna HMGA1b(1-90) a partir d’un cultiu bacterià d’Escherichia coli. Seguidament, s’ha purificat aquesta proteïna fins l’alt grau de puresa requerit utilitzant cromatografia de bescanvi iònic seguida de cromatografia de gel-filtració. Posteriorment, s’han realitzat assajos cristal·logràfics per a obtenir els co-cristalls necessaris per a poder resoldre, mitjançant difracció de raigs X, l’estructura tridimensional del complex oligonucleòtid-proteïna. Els dos oligonucleòtids sintètics emprats en aquest projecte són l’A2TA2T2AT2 i el G3A3T3C3. En una última etapa del projecte, s’han realitzat també assajos cristal·logràfics amb un pèptid sintètic que es correspon amb el tercer “AThook” de la proteïna d’estudi i l’oligonucleòtid A2TA2T2AT2.