Màster universitari en Enginyeria Biotecnològica
http://hdl.handle.net/2099.1/7879
2024-03-28T22:10:51ZEstudio estructural de complejos de oligonucleótidos ricos en adenina y timina con la proteína HMGB1
http://hdl.handle.net/2117/77742
Estudio estructural de complejos de oligonucleótidos ricos en adenina y timina con la proteína HMGB1
García Gómez, Sonia
La familia de proteínas HMGB pertenece a la superfamilia de las proteínas HMG (High Mobility Group), que son las proteínas más abundantes en la cromatina después de las histonas. Las HMGB se unen al surco estrecho del ADN (ácido desoxirribonucleico) con poca o ninguna especificidad de secuencia, a partir de un motivo de unión al ADN denominado HMG-box. Existen dos dominios de HMG-box en las proteínas HMGB, las llamadas box A y box B. Cada una de ellas contiene aproximadamente 75 aminoácidos y presenta un plegamiento característico en forma de L que consta de tres hélices α. A través de estos dominios de unión al ADN, las HMGB inducen cambios estructurales en la cromatina, fomentando la unión de complejos de nucleoproteína que controlan los procesos del ADN, incluyendo la transcripción. Las proteínas HMGB están también implicadas en diferentes enfermedades y algunos tipos de cáncer, por ello su estudio estructural despierta un gran interés en el estudio de estrategias terapéuticas. Con este fin, se busca la obtención de cristales de la proteína HMGB1 con distintos oligonucleótidos.
Para obtener la proteína HMGB1, mediante el empleo de técnicas de ingeniería genética se introdujo en la bacteria Escherichia coli un plásmido que contiene: el gen que expresa la proteína de interés, un gen que confiere a la bacteria resistencia a la ampicilina (para poder seleccionar las bacterias que han incorporado el plásmido) y una cola GST (Glutatión S-transferasa) que facilita la posterior purificación de la proteína. La expresión de la proteína se indujo mediante la adición de IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido). Una vez expresada la proteína, ésta se ha de purificar hasta obtener muestras de elevada pureza para que se puedan cristalizar. Para ello, tras extraer la proteína del interior de la célula, se aplicaron tres técnicas cromatográficas diferentes (cromatografía de afinidad, de intercambio catiónico y de exclusión molecular).
A continuación se realizaron ensayos cristalográficos de distintos complejos HMGB1-ADN con secuencias ricas en adenina y timina mediante la técnica de difusión de vapor en gota colgante. Para encontrar condiciones óptimas de cristalización, se ensayaron distintas variables (relación proteína-ADN, pH, sales, etc.). Tras la obtención de cristales, éstos se pescaron y se congelaron en nitrógeno líquido. Posteriormente se procedió a su difracción mediante rayos X en el sincrotrón ALBA. Los datos obtenidos se procesaron mediante diferentes programas de ordenador para la resolución de la estructura. El método de resolución a emplear fue el de reemplazamiento molecular. A través del análisis de los diagramas de difracción obtenidos se ha resuelto la estructura del ADN, aunque se requiere la obtención de un cristal con más orden para poder precisar la posición de la proteína.
2015-10-14T18:26:39ZGarcía Gómez, SoniaLa familia de proteínas HMGB pertenece a la superfamilia de las proteínas HMG (High Mobility Group), que son las proteínas más abundantes en la cromatina después de las histonas. Las HMGB se unen al surco estrecho del ADN (ácido desoxirribonucleico) con poca o ninguna especificidad de secuencia, a partir de un motivo de unión al ADN denominado HMG-box. Existen dos dominios de HMG-box en las proteínas HMGB, las llamadas box A y box B. Cada una de ellas contiene aproximadamente 75 aminoácidos y presenta un plegamiento característico en forma de L que consta de tres hélices α. A través de estos dominios de unión al ADN, las HMGB inducen cambios estructurales en la cromatina, fomentando la unión de complejos de nucleoproteína que controlan los procesos del ADN, incluyendo la transcripción. Las proteínas HMGB están también implicadas en diferentes enfermedades y algunos tipos de cáncer, por ello su estudio estructural despierta un gran interés en el estudio de estrategias terapéuticas. Con este fin, se busca la obtención de cristales de la proteína HMGB1 con distintos oligonucleótidos.
Para obtener la proteína HMGB1, mediante el empleo de técnicas de ingeniería genética se introdujo en la bacteria Escherichia coli un plásmido que contiene: el gen que expresa la proteína de interés, un gen que confiere a la bacteria resistencia a la ampicilina (para poder seleccionar las bacterias que han incorporado el plásmido) y una cola GST (Glutatión S-transferasa) que facilita la posterior purificación de la proteína. La expresión de la proteína se indujo mediante la adición de IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido). Una vez expresada la proteína, ésta se ha de purificar hasta obtener muestras de elevada pureza para que se puedan cristalizar. Para ello, tras extraer la proteína del interior de la célula, se aplicaron tres técnicas cromatográficas diferentes (cromatografía de afinidad, de intercambio catiónico y de exclusión molecular).
A continuación se realizaron ensayos cristalográficos de distintos complejos HMGB1-ADN con secuencias ricas en adenina y timina mediante la técnica de difusión de vapor en gota colgante. Para encontrar condiciones óptimas de cristalización, se ensayaron distintas variables (relación proteína-ADN, pH, sales, etc.). Tras la obtención de cristales, éstos se pescaron y se congelaron en nitrógeno líquido. Posteriormente se procedió a su difracción mediante rayos X en el sincrotrón ALBA. Los datos obtenidos se procesaron mediante diferentes programas de ordenador para la resolución de la estructura. El método de resolución a emplear fue el de reemplazamiento molecular. A través del análisis de los diagramas de difracción obtenidos se ha resuelto la estructura del ADN, aunque se requiere la obtención de un cristal con más orden para poder precisar la posición de la proteína.Elaboración de un modelo 3D del receptor Humano de NK1 a partir del receptor delta Opiode
http://hdl.handle.net/2117/77361
Elaboración de un modelo 3D del receptor Humano de NK1 a partir del receptor delta Opiode
Vílchez Cruz, Ángela
La publicación de la primera estructura cristalográfica de resolución atómica de un
miembro de la familia de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) como es la Rodopsina Bovina
(Rho) (1)marcó el comienzo de los estudios sobre la relación entre la actividad biológica y la
estructura de estas proteínas (1,2). Si bien se han llevado a cabo numerosos estudios de difracción
de rayos X de las estructuras de GPCRs desde ese momento, dada la dificultad de cristalización de
este tipo de proteínas, aun no se dispone hoy en día de la estructura tridimensional a nivel
atómico de un gran número de GPCRs, entre ellos del receptor de Neuroquinina (NK1-R). Sin embargo,
dado que los GPCRs comparten una estructura de 7 hélices de transmembrana enlazadas por loops se
han podido producir modelos de diferentes receptores de membrana por homología de secuencia (2; 3;
4).
El receptor NKI-R está involucrado en muchos eventos celulares de inflamación, dolor, trastornos
neuronales, del sistema digestivo y del sistema inmune, incluyendo cáncer (4), un modelo 3D de este
receptor puede ser utilizado para conocer con más detalle los principios básicos moleculares de su
actividad biológica y ser utilizado en el diseño racional de fármacos. En el presente trabajo se ha
obtenido un modelo del receptor NK1R mediante modelización por homología de secuencia (HM) y
dinámica molecular (DM), utilizando la estructura 3D de alta resolución (1.8 Å) del receptor
delta-opioide presentado el 2014. El modelo final fue utilizado para el anclaje de cinco
antagonistas no peptídicos, confirmando las interacciones con ciertos residuos presentes en el
sitio activo, en concordancia con estudios de mutagénesis dirigida. Estos resultados han permitido
definir un farmacóforo 3D que cumplió con al menos dos puntos, al evaluar el docking con 5
diferentes antagonistas no peptídicos, conocidos por su eficacia terapéutica y su alta afinidad por
el receptor.
El modelo refinado del receptor NK1-R sugiere algunos residuos claves en el sitio de unión, de los
cuales no se tiene referencia en estudios previos de mutagénesis dirigida,
así mismo el farmacóforo obtenido presenta características útiles para el diseño racional de fármacos esto puede significar nuevos retos para futuras investigaciones.
Los resultados y conclusiones obtenidos se detallan en las secciones respectivas del
presente informe.
2015-10-05T17:45:56ZVílchez Cruz, ÁngelaLa publicación de la primera estructura cristalográfica de resolución atómica de un
miembro de la familia de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) como es la Rodopsina Bovina
(Rho) (1)marcó el comienzo de los estudios sobre la relación entre la actividad biológica y la
estructura de estas proteínas (1,2). Si bien se han llevado a cabo numerosos estudios de difracción
de rayos X de las estructuras de GPCRs desde ese momento, dada la dificultad de cristalización de
este tipo de proteínas, aun no se dispone hoy en día de la estructura tridimensional a nivel
atómico de un gran número de GPCRs, entre ellos del receptor de Neuroquinina (NK1-R). Sin embargo,
dado que los GPCRs comparten una estructura de 7 hélices de transmembrana enlazadas por loops se
han podido producir modelos de diferentes receptores de membrana por homología de secuencia (2; 3;
4).
El receptor NKI-R está involucrado en muchos eventos celulares de inflamación, dolor, trastornos
neuronales, del sistema digestivo y del sistema inmune, incluyendo cáncer (4), un modelo 3D de este
receptor puede ser utilizado para conocer con más detalle los principios básicos moleculares de su
actividad biológica y ser utilizado en el diseño racional de fármacos. En el presente trabajo se ha
obtenido un modelo del receptor NK1R mediante modelización por homología de secuencia (HM) y
dinámica molecular (DM), utilizando la estructura 3D de alta resolución (1.8 Å) del receptor
delta-opioide presentado el 2014. El modelo final fue utilizado para el anclaje de cinco
antagonistas no peptídicos, confirmando las interacciones con ciertos residuos presentes en el
sitio activo, en concordancia con estudios de mutagénesis dirigida. Estos resultados han permitido
definir un farmacóforo 3D que cumplió con al menos dos puntos, al evaluar el docking con 5
diferentes antagonistas no peptídicos, conocidos por su eficacia terapéutica y su alta afinidad por
el receptor.
El modelo refinado del receptor NK1-R sugiere algunos residuos claves en el sitio de unión, de los
cuales no se tiene referencia en estudios previos de mutagénesis dirigida,
así mismo el farmacóforo obtenido presenta características útiles para el diseño racional de fármacos esto puede significar nuevos retos para futuras investigaciones.
Los resultados y conclusiones obtenidos se detallan en las secciones respectivas del
presente informe.Impregnation of PLA porous matrices with inclusion bodies for their use as scaffolds in Tissue Engineering
http://hdl.handle.net/2099.1/24646
Impregnation of PLA porous matrices with inclusion bodies for their use as scaffolds in Tissue Engineering
Aguado Olalla, María
Regenerative medicine integrates different biomedical approaches to restore normal function in damaged tissues using a combination of cell/molecular biology and materials engineering. One of the most promising alternatives is to design a biodegradable and porous scaffold decorated with inductive factors that promote cell colonization and proliferation. In this context, an appropriate processing of the polymer is required in order to obtain a scaffold that acts as a support for tissue growth.
In this work is developed a new route for the preparation of porous matrices with appropriate physico-chemical and biological properties using supercritical fluid technology. In special, we investigate the PLA polymer to obtain 3D porous scaffolds and its decoration with bacterial inclusion bodies. IB’s have been revealed as adhesive, mechanically and biocompatible protein materials that can be used to favour cell colonization and proliferation when used to decorated flat surfaces.
The synthesis of new matrices with improved properties concerning porosity, interconnectivity and mechanical properties has been possible using supercritical fluid technology for the processing of PLA. In addition, the decoration of PLA porous scaffolds with bacterial inclusion bodies promotes cell adhesion and colonization. Inclusion bodies do not result toxic to the cells and contrarily improve cell proliferation on the surface. The hybrid polymeric-IB’s porous matrices obtained for the first time is this work are promising platforms to be used in bone tissue engineering.
2015-01-21T19:55:19ZAguado Olalla, MaríaRegenerative medicine integrates different biomedical approaches to restore normal function in damaged tissues using a combination of cell/molecular biology and materials engineering. One of the most promising alternatives is to design a biodegradable and porous scaffold decorated with inductive factors that promote cell colonization and proliferation. In this context, an appropriate processing of the polymer is required in order to obtain a scaffold that acts as a support for tissue growth.
In this work is developed a new route for the preparation of porous matrices with appropriate physico-chemical and biological properties using supercritical fluid technology. In special, we investigate the PLA polymer to obtain 3D porous scaffolds and its decoration with bacterial inclusion bodies. IB’s have been revealed as adhesive, mechanically and biocompatible protein materials that can be used to favour cell colonization and proliferation when used to decorated flat surfaces.
The synthesis of new matrices with improved properties concerning porosity, interconnectivity and mechanical properties has been possible using supercritical fluid technology for the processing of PLA. In addition, the decoration of PLA porous scaffolds with bacterial inclusion bodies promotes cell adhesion and colonization. Inclusion bodies do not result toxic to the cells and contrarily improve cell proliferation on the surface. The hybrid polymeric-IB’s porous matrices obtained for the first time is this work are promising platforms to be used in bone tissue engineering.Diseño de una planta de producción de astaxantina
http://hdl.handle.net/2099.1/23718
Diseño de una planta de producción de astaxantina
Pastor Folch, Jordi
La astaxantina es un carotenoide que se encuentra de forma natural en especies del medio marino. En los últimos años ha suscitado un gran interés por parte de la comunidad científica, gracias a la evidencia creciente por diferentes estudios in vitro, in vivo en animales y ensayos clínicos en humanos, que sugieren que la astaxantina tiene un potencial de efectos promotores sobre la salud, en la prevención y tratamiento de diversas enfermedades. La aplicación de la molécula se ha consolidado en diferentes sectores, como en alimentación animal, nutracéutica o cosmética, pero sobretodo, su interés radica en el desarrollo dentro de la industria farmacéutica. En el presente trabajo se ha diseñado un proceso de producción a partir de la microalga Haematococcus pluvialis, que sintetiza la molécula como un mecanismo de defensa propio. Se han descrito las principales etapas y equipos, así como, mediante un estudio económico se ha demostrado la viabilidad del proceso.
2014-11-14T12:43:03ZPastor Folch, JordiLa astaxantina es un carotenoide que se encuentra de forma natural en especies del medio marino. En los últimos años ha suscitado un gran interés por parte de la comunidad científica, gracias a la evidencia creciente por diferentes estudios in vitro, in vivo en animales y ensayos clínicos en humanos, que sugieren que la astaxantina tiene un potencial de efectos promotores sobre la salud, en la prevención y tratamiento de diversas enfermedades. La aplicación de la molécula se ha consolidado en diferentes sectores, como en alimentación animal, nutracéutica o cosmética, pero sobretodo, su interés radica en el desarrollo dentro de la industria farmacéutica. En el presente trabajo se ha diseñado un proceso de producción a partir de la microalga Haematococcus pluvialis, que sintetiza la molécula como un mecanismo de defensa propio. Se han descrito las principales etapas y equipos, así como, mediante un estudio económico se ha demostrado la viabilidad del proceso.Implementación de un sistema de garantía de calidad en un laboratorio de ensayos Químicos y Microbiológicos
http://hdl.handle.net/2099.1/23713
Implementación de un sistema de garantía de calidad en un laboratorio de ensayos Químicos y Microbiológicos
López Medina, Daniel
El principal objetivo de un laboratorio es producir resultados fiables, por lo que ésta es la
actividad que debe recibir mayor atención.
La garantía de calidad de estos resultados no es una carga adicional ni una actividad
suplementaria que pueda tomarse o dejarse, sino que constituye uno de los instrumentos
fundamentales de administración para el director y su personal, con miras a alcanzar los
objetivos fijados.
Para ello se ha realizado el estudio de varios puntos, desde las instalaciones necesarias
hasta los controles de calidad externos que se deben realizar, con el fin de poder
implementar este sistema de garantía de calidad en un laboratorio. A lo largo de esta
memoria se ha realizado el estudio de los diferentes puntos clave que se deben tener en
cuenta, a nivel de laboratorio, para poder implementar este sistema de garantía de calidad.
Lo primero es saber que condiciones deben cumplir las instalaciones en las cuales
queremos implementar este sistema de garantía de calidad. Existen normativas
específicas, sobretodo a nivel de microbiología, que deben ser cumplidas.
También el personal que forma parte del laboratorio debe estar evaluado y capacitado para
poder asegurar la fiabilidad de los resultados emitidos.
Se han tenido en cuenta puntos más técnicos. Se ha explicado la importancia de la
calibración/verificación de los equipos del laboratorio, como establecer criterios de
aceptación, que parámetros evaluar en función de la categoría de cada uno y como realizar
un planning de calibración. También se ha desarrollado un procedimiento para caracterizar
medios isotermos que implicará un ahorro considerable de los gastos de calibración del
laboratorio.
Se han validado métodos, tanto de Biología molecular como ELISA, para posteriormente
realizar ensayos en rutina en el laboratorio. Los resultados obtenidos en ambas
validaciones han sido satisfactorios, cumpliendo en todos los puntos estudiados, los
criterios de calidad previamente establecidos. Durante esta validación también se han
marcado los controles de calidad internos que se deberían hacer, de forma frecuente, en
cada uno de los métodos. Relacionado con los controles de calidad también se ha descrito
como realizar controles de calidad externos, como seleccionarlos y evaluarlos.
2014-11-14T08:09:50ZLópez Medina, DanielEl principal objetivo de un laboratorio es producir resultados fiables, por lo que ésta es la
actividad que debe recibir mayor atención.
La garantía de calidad de estos resultados no es una carga adicional ni una actividad
suplementaria que pueda tomarse o dejarse, sino que constituye uno de los instrumentos
fundamentales de administración para el director y su personal, con miras a alcanzar los
objetivos fijados.
Para ello se ha realizado el estudio de varios puntos, desde las instalaciones necesarias
hasta los controles de calidad externos que se deben realizar, con el fin de poder
implementar este sistema de garantía de calidad en un laboratorio. A lo largo de esta
memoria se ha realizado el estudio de los diferentes puntos clave que se deben tener en
cuenta, a nivel de laboratorio, para poder implementar este sistema de garantía de calidad.
Lo primero es saber que condiciones deben cumplir las instalaciones en las cuales
queremos implementar este sistema de garantía de calidad. Existen normativas
específicas, sobretodo a nivel de microbiología, que deben ser cumplidas.
También el personal que forma parte del laboratorio debe estar evaluado y capacitado para
poder asegurar la fiabilidad de los resultados emitidos.
Se han tenido en cuenta puntos más técnicos. Se ha explicado la importancia de la
calibración/verificación de los equipos del laboratorio, como establecer criterios de
aceptación, que parámetros evaluar en función de la categoría de cada uno y como realizar
un planning de calibración. También se ha desarrollado un procedimiento para caracterizar
medios isotermos que implicará un ahorro considerable de los gastos de calibración del
laboratorio.
Se han validado métodos, tanto de Biología molecular como ELISA, para posteriormente
realizar ensayos en rutina en el laboratorio. Los resultados obtenidos en ambas
validaciones han sido satisfactorios, cumpliendo en todos los puntos estudiados, los
criterios de calidad previamente establecidos. Durante esta validación también se han
marcado los controles de calidad internos que se deberían hacer, de forma frecuente, en
cada uno de los métodos. Relacionado con los controles de calidad también se ha descrito
como realizar controles de calidad externos, como seleccionarlos y evaluarlos.Encapsulación de ADN en nanopartículas de hidroxiapatita: un modelo de vector no viral
http://hdl.handle.net/2099.1/22478
Encapsulación de ADN en nanopartículas de hidroxiapatita: un modelo de vector no viral
Chaves Barboza, Gustavo A.
The development and improvement of non-viral vectors on genetic engineering has been the
subject of study of many researchers due to its advantages as compared to its viral
counterparts.
Among the numerous studied non-viral vectors, hydroxyapatite particles (HAP) have been
traditionally used for genetic transfection assays due to its strong interactions with nucleic
acids, low cost, low toxicity, high biocompatibility and ease of fabrication.
Amid employed vector synthesis techniques, chemical co-precipitation is most popular. It
consists of apatite crystal formation as a consequence of precipitation reactions brought
upon by addition of a phosphate source to an aqueous calcium solution. DNA adsorption
occurs on the surface of the generated apatite material.
However attractive, chemical co-precipitation presents various shortcomings such as poor
morphology control, poor particles size control, aggregates formation and DNA exposure. All these characteristics have been pointed out by several authors as some of the factors
contributing and leading to low transfection levels.
Within this context, the present study exhibits the successful encapsulation of DNA with HAP nanoparticles produced by a synthesis protocol based on chemical precipitation. The
obtained nanocapsules showed a primarily spherical morphology and good dispersion.
Moreover, the protecting effect of HAP capsule material upon DNA integrity was confirmed by endonucleases attack studies as well as genetic material liberation under acidic biomimetic environment.
Finally, the transfection viability of the synthesized nanoparticles was successfully evaluated by means of bacterial transformation under in-vitro conditions, thus demonstrating the biotechnological potential as non-viral vectors.
2014-09-19T09:17:51ZChaves Barboza, Gustavo A.The development and improvement of non-viral vectors on genetic engineering has been the
subject of study of many researchers due to its advantages as compared to its viral
counterparts.
Among the numerous studied non-viral vectors, hydroxyapatite particles (HAP) have been
traditionally used for genetic transfection assays due to its strong interactions with nucleic
acids, low cost, low toxicity, high biocompatibility and ease of fabrication.
Amid employed vector synthesis techniques, chemical co-precipitation is most popular. It
consists of apatite crystal formation as a consequence of precipitation reactions brought
upon by addition of a phosphate source to an aqueous calcium solution. DNA adsorption
occurs on the surface of the generated apatite material.
However attractive, chemical co-precipitation presents various shortcomings such as poor
morphology control, poor particles size control, aggregates formation and DNA exposure. All these characteristics have been pointed out by several authors as some of the factors
contributing and leading to low transfection levels.
Within this context, the present study exhibits the successful encapsulation of DNA with HAP nanoparticles produced by a synthesis protocol based on chemical precipitation. The
obtained nanocapsules showed a primarily spherical morphology and good dispersion.
Moreover, the protecting effect of HAP capsule material upon DNA integrity was confirmed by endonucleases attack studies as well as genetic material liberation under acidic biomimetic environment.
Finally, the transfection viability of the synthesized nanoparticles was successfully evaluated by means of bacterial transformation under in-vitro conditions, thus demonstrating the biotechnological potential as non-viral vectors.Diseño de una planta de producción de factor de crecimiento de colonias de granulocitos (G-CSF)
http://hdl.handle.net/2099.1/22142
Diseño de una planta de producción de factor de crecimiento de colonias de granulocitos (G-CSF)
Valls Pepió, Laia
La neutropenia es un estado clínico provocado por un conteo bajo de neutrófilos. Esta
alteración se da sobre todo por la quimioterapia mielosupresora. El factor estimulante de
colonias de granulocitos aumenta el conteo de neutrófilos.
En el presente trabajo se realiza un estudio bibliográfico exhaustivo sobre de los productos
farmacéuticos del factor estimulante de colonias de granulocitos recombinante humano
(rHuG-CSF). Se analiza sus propiedades farmacológicas, sus indicaciones,
contraindicaciones y se escoge la mejor opción para la producción en el mercado Español.
Se describe el proceso de producción del principio activo de PEGFilgrastim, que se ha
determinado que va a ser la forma a producir. Se escoge esta forma porque se puede
producir en E. coli y presenta una vida media en sangre superior a la forma no pegilada.
Se dimensionan los equipos necesarios en el proceso de producción, se propone una línea
de actuación de los residuos generados en la planta y se realiza un estudio económico para
determinar la viabilidad de la planta.
2014-07-24T11:45:27ZValls Pepió, LaiaLa neutropenia es un estado clínico provocado por un conteo bajo de neutrófilos. Esta
alteración se da sobre todo por la quimioterapia mielosupresora. El factor estimulante de
colonias de granulocitos aumenta el conteo de neutrófilos.
En el presente trabajo se realiza un estudio bibliográfico exhaustivo sobre de los productos
farmacéuticos del factor estimulante de colonias de granulocitos recombinante humano
(rHuG-CSF). Se analiza sus propiedades farmacológicas, sus indicaciones,
contraindicaciones y se escoge la mejor opción para la producción en el mercado Español.
Se describe el proceso de producción del principio activo de PEGFilgrastim, que se ha
determinado que va a ser la forma a producir. Se escoge esta forma porque se puede
producir en E. coli y presenta una vida media en sangre superior a la forma no pegilada.
Se dimensionan los equipos necesarios en el proceso de producción, se propone una línea
de actuación de los residuos generados en la planta y se realiza un estudio económico para
determinar la viabilidad de la planta.Obtención de receptores muscarínicos de acetilcolina recombinantes involucrados en patologías neurodegenerativas
http://hdl.handle.net/2099.1/21484
Obtención de receptores muscarínicos de acetilcolina recombinantes involucrados en patologías neurodegenerativas
Martínez Sánchez, Luz del Carmen
Recientemente se han logrado grandes avances en la determinación de la estructura y función de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR’s). Los GPCR´s constituyen gran familia de proteína integrales de membrana y se encuentran implicados en una gran variedad de procesos fisiológicos como la respuesta a hormonas y neurotransmisores, así como también son centrales en los sistemas sensoriales mediando las respuestas en los sentidos de la vista, olfato y el gusto.
Entre ellos se encuentra la familia de los receptores muscarínicos de acetilcolina, compuesta por 5 subtipos de receptores (M1-M5), los cuales modulan la mayor parte de las acciones del neurotransmisor acetilcolina en el sistema nervioso central y en el sistema nervioso periférico. Los receptores muscarínicos han jugado un papel muy relevante en la compresión del funcionamiento de la neurotransmisión. En este trabajo nos centraremos únicamente en los receptores M1 y M3 debido a su potencial participación en el mecanismo molecular de la enfermedad de Alzheimer
Hasta ahora se ha visto que estos receptores se encuentran implicados en varias patologías del sistema nervioso central, ya que modulan la señalización de diferentes sistemas neurotransmisores. Estos sistemas se ven alterados como en el caso de la enfermedad de Alzheimer, donde se ha visto que modulan la degradación de la APP (proteína precursora de amiloide) por la α-secretasa y de esta forma evitan la formación de las placas neuríticas conocidas como β-amiloides (Aβ) características de esta enfermedad. Además se ha sugerido que como resultado de su interacción con la proteína tau, pueden jugar un papel muy relevante en la pérdida de neuronas colinérgicas a través de un mecanismo que involucra la interacción intracelular y extracelular de la proteína tau con los receptores muscarínicos M1/M3 presentes en este tipo de neuronas.
El objetivo de este trabajo es comprender y analizar detalladamente las propiedades biológicas y bioquímicas de las diferentes isoformas de la proteína tau (ya sean fragmentos o la proteína completa soluble) así como las posibles interacciones que puedan tener con los receptores muscarínicos en relación a su implicación con el Alzheimer. Para ello, el principal logro ha sido optimizar las metodologías de expresión y purificación de la proteína tau. Ello ha permitido, por primera vez en nuestro grupo, la obtención de la proteína tau purificada, así como también la obtención de los receptores muscarínicos mediante su expresión en líneas celulares apropiadas.
2014-05-20T17:53:25ZMartínez Sánchez, Luz del CarmenRecientemente se han logrado grandes avances en la determinación de la estructura y función de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR’s). Los GPCR´s constituyen gran familia de proteína integrales de membrana y se encuentran implicados en una gran variedad de procesos fisiológicos como la respuesta a hormonas y neurotransmisores, así como también son centrales en los sistemas sensoriales mediando las respuestas en los sentidos de la vista, olfato y el gusto.
Entre ellos se encuentra la familia de los receptores muscarínicos de acetilcolina, compuesta por 5 subtipos de receptores (M1-M5), los cuales modulan la mayor parte de las acciones del neurotransmisor acetilcolina en el sistema nervioso central y en el sistema nervioso periférico. Los receptores muscarínicos han jugado un papel muy relevante en la compresión del funcionamiento de la neurotransmisión. En este trabajo nos centraremos únicamente en los receptores M1 y M3 debido a su potencial participación en el mecanismo molecular de la enfermedad de Alzheimer
Hasta ahora se ha visto que estos receptores se encuentran implicados en varias patologías del sistema nervioso central, ya que modulan la señalización de diferentes sistemas neurotransmisores. Estos sistemas se ven alterados como en el caso de la enfermedad de Alzheimer, donde se ha visto que modulan la degradación de la APP (proteína precursora de amiloide) por la α-secretasa y de esta forma evitan la formación de las placas neuríticas conocidas como β-amiloides (Aβ) características de esta enfermedad. Además se ha sugerido que como resultado de su interacción con la proteína tau, pueden jugar un papel muy relevante en la pérdida de neuronas colinérgicas a través de un mecanismo que involucra la interacción intracelular y extracelular de la proteína tau con los receptores muscarínicos M1/M3 presentes en este tipo de neuronas.
El objetivo de este trabajo es comprender y analizar detalladamente las propiedades biológicas y bioquímicas de las diferentes isoformas de la proteína tau (ya sean fragmentos o la proteína completa soluble) así como las posibles interacciones que puedan tener con los receptores muscarínicos en relación a su implicación con el Alzheimer. Para ello, el principal logro ha sido optimizar las metodologías de expresión y purificación de la proteína tau. Ello ha permitido, por primera vez en nuestro grupo, la obtención de la proteína tau purificada, así como también la obtención de los receptores muscarínicos mediante su expresión en líneas celulares apropiadas.Estudio de la hidrofobicidad de membrana como pre-screening de cepas probióticas con capacidad adhesiva
http://hdl.handle.net/2099.1/21453
Estudio de la hidrofobicidad de membrana como pre-screening de cepas probióticas con capacidad adhesiva
Martínez Cazalla, Anna
La capacidad de adhesión de las bacterias probióticas a las células epiteliales es una de las características más importantes para decidir si la bacteria es apta para ser designada como probiótico y emplearse en la alimentación. La determinación de la hidrofobicidad a
hidrocarburos se cree que podría resultar un método de pre-screening de bacterias
candidatas a presentar buenas propiedades de adhesión, método más rápido, con menor
inversión de equipos y material y mucho más económico. Asimismo, se cree que la
adhesión está fuertemente relacionada con la presencia de proteínas de membrana
llamadas S-layer.
Se ha trabajado con una colección de 58 cepas pertenecientes a diferentes especies de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium, de los cuales se han obtenido buenos porcentajes
de hidrofobicidad para L.gasseri, donde se ha logrado demostrar la presencia de proteínas de tipo S-layer, en este caso APF2, L.oris, B.bifidum, B.longum infantis (CECT7210) y dos
cepas de B.longum longum y B.breve que destacan sobre las demás cepas de su especie,
coincidiendo con el hecho de que se encuentran más alejadas filogenéticamente dentro de los miembros de su misma especie. Además, se observa como la especie L.casei presenta
diferencias significativas en la hidrofobicidad cuando el crecimiento del cultivo se lleva a cabo en condiciones aerobias o anaerobias.
Se seleccionan estas cepas para ver si el uso de distintos prebióticos como fuente de
carbono principal produce efectos en la hidrofobicidad, usando como valor de referencia un medio mínimo de Norris, que se acerca más a las condiciones que se encuentran en el
intestino. Se aprecia que la influencia de los prebióticos suele ser positiva, especialmente con el uso del prebiótico 1, aunque no existe un patrón de comportamiento extensible para todas las bacterias, sino que depende de las especies o, incluso, de la propia cepa.
Se demuestra la implicación de las proteínas de membrana tipo S-layer en la
hidrofobicidad, a partir de un tratamiento con LiCl, agente desnaturalizante, obteniéndose un descenso de la hidrofobicidad en cepas como L. gasseri y L. casei hasta niveles del 26% y 66% en condiciones de aerobiosis, donde se produce una mayor expresión. El género
Bifidobacterium, por el contrario, no parece tener efectos destacables, pero si se ha podido establecer una relación de la hidrofobicidad con la formación de agregados, siendo más
elevado el porcentaje de hidrofobicidad cuanto mayor sea la presencia de agregados al
observar las bacterias mediante microscopía óptica.
Se puede decir, por tanto, que la hidrofobicidad es un buen método para seleccionar bacterias con altas probabilidades de presentar buena capacidad de adhesión.
2014-05-16T18:53:28ZMartínez Cazalla, AnnaLa capacidad de adhesión de las bacterias probióticas a las células epiteliales es una de las características más importantes para decidir si la bacteria es apta para ser designada como probiótico y emplearse en la alimentación. La determinación de la hidrofobicidad a
hidrocarburos se cree que podría resultar un método de pre-screening de bacterias
candidatas a presentar buenas propiedades de adhesión, método más rápido, con menor
inversión de equipos y material y mucho más económico. Asimismo, se cree que la
adhesión está fuertemente relacionada con la presencia de proteínas de membrana
llamadas S-layer.
Se ha trabajado con una colección de 58 cepas pertenecientes a diferentes especies de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium, de los cuales se han obtenido buenos porcentajes
de hidrofobicidad para L.gasseri, donde se ha logrado demostrar la presencia de proteínas de tipo S-layer, en este caso APF2, L.oris, B.bifidum, B.longum infantis (CECT7210) y dos
cepas de B.longum longum y B.breve que destacan sobre las demás cepas de su especie,
coincidiendo con el hecho de que se encuentran más alejadas filogenéticamente dentro de los miembros de su misma especie. Además, se observa como la especie L.casei presenta
diferencias significativas en la hidrofobicidad cuando el crecimiento del cultivo se lleva a cabo en condiciones aerobias o anaerobias.
Se seleccionan estas cepas para ver si el uso de distintos prebióticos como fuente de
carbono principal produce efectos en la hidrofobicidad, usando como valor de referencia un medio mínimo de Norris, que se acerca más a las condiciones que se encuentran en el
intestino. Se aprecia que la influencia de los prebióticos suele ser positiva, especialmente con el uso del prebiótico 1, aunque no existe un patrón de comportamiento extensible para todas las bacterias, sino que depende de las especies o, incluso, de la propia cepa.
Se demuestra la implicación de las proteínas de membrana tipo S-layer en la
hidrofobicidad, a partir de un tratamiento con LiCl, agente desnaturalizante, obteniéndose un descenso de la hidrofobicidad en cepas como L. gasseri y L. casei hasta niveles del 26% y 66% en condiciones de aerobiosis, donde se produce una mayor expresión. El género
Bifidobacterium, por el contrario, no parece tener efectos destacables, pero si se ha podido establecer una relación de la hidrofobicidad con la formación de agregados, siendo más
elevado el porcentaje de hidrofobicidad cuanto mayor sea la presencia de agregados al
observar las bacterias mediante microscopía óptica.
Se puede decir, por tanto, que la hidrofobicidad es un buen método para seleccionar bacterias con altas probabilidades de presentar buena capacidad de adhesión.Effect of the ligand in the Modeling the 3d structure of the m3 muscarinic receptor
http://hdl.handle.net/2099.1/21428
Effect of the ligand in the Modeling the 3d structure of the m3 muscarinic receptor
Rasaeifar, Bahareh
There are still many question open to completely understand the structure-activity relationships of G-protein coupled receptors. Issues like the actual mapping of the binding site of different subtypes, as well as the mechanism of activation are poorly understood [1]. Accordingly, further studies on the structure-activity relationships are necessary. In this regard, only a few 3D structures are available from X-ray diffraction studies. Computational studies can complement this information through the construction of reliable 3D models.
The goal of the present work is to evaluate the effect of using different ligands to obtain reliable models of the three-dimensional structure of a G-protein coupled receptor using a specific template. Specifically, we have constructed in the present work a three dimensional model of the M3 muscarinic receptor by homology modelling, using the X-ray structure of M2 muscarinic acetylcholine receptor as template and the sequence analyses of muscarinic acetylcholine receptor family. Furthermore, we have studied the effect of the ligand used in the modelling process. For this purpose three models of the receptor were built, including one without ligand and two models with the selective antagonists tiotropium and N-Methylscopolamine, respectively docked into the orthosteric binding site.
The constructed models were refined using molecular dynamic calculations to analyze the effect of ligand refinement process and to derive significant conformational information. Based on the analysis of the refined models done through the calculations of RMSD, RMSF, visualization of the structures and comparison between the refined models and the crystal structure of M3 muscarinic receptor, the addition of a ligand in construction of homology model (and the subsequent refinement process) stabilize the structure. Furthermore, the similarities in the structure conformations of both refined models of M3 muscarinic-ligand complexes and the crystal structure of the M3 muscarinic receptors, suggest that the methodology used in this study can be used in prediction of 3D structure prediction GPCR in the absence of crystal structures.
2014-05-14T18:22:59ZRasaeifar, BaharehThere are still many question open to completely understand the structure-activity relationships of G-protein coupled receptors. Issues like the actual mapping of the binding site of different subtypes, as well as the mechanism of activation are poorly understood [1]. Accordingly, further studies on the structure-activity relationships are necessary. In this regard, only a few 3D structures are available from X-ray diffraction studies. Computational studies can complement this information through the construction of reliable 3D models.
The goal of the present work is to evaluate the effect of using different ligands to obtain reliable models of the three-dimensional structure of a G-protein coupled receptor using a specific template. Specifically, we have constructed in the present work a three dimensional model of the M3 muscarinic receptor by homology modelling, using the X-ray structure of M2 muscarinic acetylcholine receptor as template and the sequence analyses of muscarinic acetylcholine receptor family. Furthermore, we have studied the effect of the ligand used in the modelling process. For this purpose three models of the receptor were built, including one without ligand and two models with the selective antagonists tiotropium and N-Methylscopolamine, respectively docked into the orthosteric binding site.
The constructed models were refined using molecular dynamic calculations to analyze the effect of ligand refinement process and to derive significant conformational information. Based on the analysis of the refined models done through the calculations of RMSD, RMSF, visualization of the structures and comparison between the refined models and the crystal structure of M3 muscarinic receptor, the addition of a ligand in construction of homology model (and the subsequent refinement process) stabilize the structure. Furthermore, the similarities in the structure conformations of both refined models of M3 muscarinic-ligand complexes and the crystal structure of the M3 muscarinic receptors, suggest that the methodology used in this study can be used in prediction of 3D structure prediction GPCR in the absence of crystal structures.