Puesta a punto de un sistema de detección y enumeración de Brettanomices spp y bacterias acéticas en vino mediante la PCR a tiempo real

Abstract

Currently there are many methods for the identification of Brettanomyces spp and acetic acid bacteria; however, the traditional methods have several disadvantages as high detection thresholds, waiting times, false positives, lack of differentiation between living and dead cells, etc. For all these reasons there is a need to apply a reliable, specific and preventive method, because the wine process is very dynamic and these types of microorganisms can contaminate the product resulting in the alteration of the aromatic qualities, the taste of the wine, and in some situation the loss of the vinified product. The objectives of this paper is: i) to develop a system for detection and enumeration of acetic bacteria and Brettanomyces in wine by the real-time PCR, ii) to provide a level of detection of 102 cells/ml, iii) to assess the ability to apply this technique in routine analysis of wines, iv) to use various commercial kits for the verification of the efficiency, sensitivity, speed and reproducibility with the real-time PCR. This technique allows us, by polymerase chain reaction in real time, to identify and list these wine contaminants. It uses fluorescent indicator molecules to monitor the production of amplification products during each cycle of the PCR reaction. Using the kit the foodproof® Dekkera quantification in the real-time PCR, it has been achieved quantifying 1E+00 number of copies / ml with an acceptable efficiency of 96%, reproducible and reliable results. The kit the foodproof® Dekkera quantification allows to quantify the DNA of living cells by the addition of Reagent D and also allows the detection and enumeration of Brettanomyces without purifying DNA since no differences were found in the counting of number of copies / ml with and without purification. In the detection and enumeration of acetic bacteria by real-time PCR it obtains a sensitivity level of 1E + 00 number of copies / ml; and presents a high efficiency of 115.59%, and a good specificity of amplification and reproducibility. All parameters are quantified by the standard curve gathered from a serial dilution of the DNA of Acetobacter aceti.

Actualment existeixen molts mètodes per a la identificació de Brettanomyces spp i bacteris acètics; però els mètodes tradicionals tenen molts inconvenients com són: alts llindars de detecció, llargs temps d'espera, falsos positius, no diferenciació entre cèl·lules vives i mortes, etc. Per tots aquests motius existeix la necessitat d'aplicar un mètode fiable, específic i preventiu, doncs el procés d'elaboració del vi és molt dinàmic i els microorganismes esmentats poden contaminar el producte provocant l'alteració de les qualitats aromàtiques i del gust del vi, i en situacions extremes, la pèrdua del producte vinificat. El present treball té per objectius: i) posar a punt un sistema de detecció i enumeració de Brettanomyces i bacteris acètics en vins mitjançant la PCR a temps real, ii) oferir un llindar de detecció de l'ordre de 102 cèl·lules/ml, iii) valorar la capacitat d'aplicar la tècnica en anàlisi rutinaris de vins, iv) utilitzar diversos kits comercials per la comprovació de l'eficiència, sensibilitat, rapidesa i reproductibilitat amb la PCR a temps real. La PCR a temps real permet mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa a temps real, identificar i enumerar aquests microorganismes contaminants en el vi. La tècnica es fonamenta en la utilització de molècules indicadores fluorescents per a monitoritzar la producció de productes d'amplificació durant cada cicle de la reacció de PCR. En la PCR a temps real utilitzant el kit the foodproof® Dekkera quantification, s'ha aconseguit una quantificació de 1E+00 nombre de còpies/ml amb una eficiència acceptable de 96%, amb resultats reproduïbles i fiables. El kit va permetre quantificar el ADN de cèl·lules vives addicionant el Reagent D. El kit the foodproof® Dekkera quantification va permetre realitzar la detecció i enumeració de Brettanomyces sense necessitat de purificar el ADN ja que no es van obtenir diferències entre els recomptes del nombre de còpies/ml amb i sense purificació. En la detecció i enumeració de bacteris acètics mitjançant la PCR a temps real s'ha obtingut un nivell de sensibilitat de 1E+00 nombre de còpies/ml; i una eficiència elevada de 115,59%, amb una bona especificitat d'amplificació i reproductibilitat. Tots els paràmetres s'han quantificat mitjançant la corba estàndard obtinguda a partir d'una dilució seriada del ADN de Acetobacter aceti.

Actualmente existen muchos métodos para la identificación de Brettanomyces spp y bacterias acéticas; no obstante, los métodos tradicionales tienen muchos inconvenientes como umbrales de detección altos, tiempos de espera, falsos positivos, no diferenciación de células vivas y muertas, etc. Por todos estos motivos existe la necesidad de aplicar un método fiable, específico y preventivo, ya que el proceso del vino es muy dinámico y este tipo de microorganismos pueden contaminar el producto provocando la alteración de las cualidades aromáticas, el gusto del vino y en situaciones extremas, la pérdida del producto vinificado. El presente trabajo tiene como objetivos: i) poner a punto un sistema de detección y enumeración de Brettanomyces y bacterias acéticas en vinos mediante la PCR a tiempo real, ii) ofrecer un nivel de detección del orden de 102 células/ml, iii) valorar la capacidad de aplicar la técnica en análisis rutinarios de vinos, iv) utilizar diversos kits comerciales para la comprobación de la eficiencia, sensibilidad, rápidez y reproducibilidad con la PCR a tiempo real. Esta técnica permite mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, identificar y enumerar estos contaminantes del vino, puesto que utiliza moléculas indicadoras fluorescentes para monitorizar la producción de productos de amplificación durante cada ciclo de la reacción de PCR. En la PCR a tiempo real utilizando el kit the foodproof® Dekkera quantification, se ha logrado una cuantificación de 1E+00 número de copias/ml con una eficiencia aceptable de 96%, con resultados reproducibles y fiables. El kit permitió cuantificar el ADN de células vivas mediante la adición del Reagent D. El kit the foodproof® Dekkera quantification permitió realizar la detección y enumeración de Brettanomyces sin necesidad de purificar el ADN ya que no se obtuvieron diferencias en el recuento de número de copias/ml con y sin purificación En la detección y enumeración de bacterias acéticas mediante PCR a tiempo real se ha obtenido un nivel de sensibilidad de 1E+00 número de copias/ml; y presentó una eficiencia elevada de 115,59%, una buena especificidad de amplificación y reproducibilidad. Todos los parámetros se han cuantificado mediante la curva estándar obtenida de una dilución serial del ADN de Acetobacter aceti.