Evaluación de la expresión de citoquinas en tejido asociado a mucosa de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) y de la dorada (Sparus aurata)

Abstract

Fish in aquaculture are permanently under the influence of various external stimuli, some of them can become stressors. Depending on their magnitude and duration, they may give rise to a physiological response with the aim of maintaining the body's homeostasis and thus preserving the welfare state. However, the response to stress can cause side effects in other types of mechanisms such as the immune response. The activation of physiological mechanisms during stress episodes releases different hormones, being cortisol the most relevant hormone in the response to stress in teleost. Cortisol is not only responsible to coordinate a series of processes aimed at generating a response to the external stimuli, but also influences the modulation of the immune system. In previous studies it has been reported that cortisol released against an acute stress response (short duration and high intensity stimuli) causes an immune-stimulating effect at systemic level. Currently, a growing interest has focused on the local response of mucosal-associated lymphoid tissue (MALT) due to its fundamental immunological role as a first line of defence against a stressor and / or pathogen. Nevertheless, the effect of cortisol on mucosal-associated lymphoid tissue (MALT) is currently unknown. For this reason, the aim of this study was to evaluate the effect of cortisol on the three main MALTs: skin (SALT), gills (GIALT) and intestine (GALT). For that reason, the tissues were incubated in vitro with a physiological concentration of cortisol simulating an acute stress situation (100 ng / 100 mg of tissue). The effect of cortisol at the local level was evaluated after 2h, 4h, and 24h of treatment by real-time PCR with the purpose of determining the modulation of different genes related to the pro-inflammatory immune response (interleukin 1β (IL- 1β) and 6, tumoral necrosis factor alpha (TNF-α) and cyclooxygenase (COX2), the anti-inflammatory immune response (interleukin 10, transforming growth factor beta) and gene expression related genes to stress response (glucocorticoid receptor (GR), 70 kDa heat shock protein). As a model of study, the sea bream (Sparus aurata) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) were used to determine if the modulation of genes in response to the presence of cortisol is conserved between species. While, in sea bream skin no modulation was observed in the evaluated genes, an increase in the expression of TNF-α and GR was observed in trout at 4 hours of treatment. In the intestine, modulation of IL-1β and COX2 was observed at 24 hours of incubation in sea bream, but in trout only COX2 expression was recorded. In gills, no significant differences were observed in both species. In conclusion, our results indicate that the incubation of cortisol in MALT produces a stimulatory, but reduced, effect of the modulation of genes associated with the immune response and stress at the level of mucosal associated tissue in both species studied.

Els peixos en aqüicultura estan permanentment sota els efectes de diferents estímuls externs, alguns d'ells poden esdevenir agents d'estrès. Depenent de la seva magnitud i durada, poden donar lloc a una resposta fisiològica amb l'objectiu de mantenir la homeòstasis del organisme i així preservar l'estat del benestar. Tant mateix, la resposta a l'estrès pot provocar efectes col·laterals a altres tipus de mecanismes com la resposta immunològica. L'activació dels mecanismes fisiològics durant episodis d'estrès alliberen diferents hormones, essent el cortisol l'hormona més rellevant durant la resposta a l'estrès en teleostis. El cortisol no només és responsable de coordinar una sèrie de processos destinats a generar una resposta enfront a l'estímul extern, si no que també repercuteix a la modulació del sistema immunològic. En estudis previs s'ha reportat que el cortisol alliberat enfront a una resposta d'estrès agut (estímul de curta durada i alta intensitat) provoca un efecte inmunoestimulant a nivell sistèmic. Actualment, un creixent interès s'ha centrat en la resposta a nivell local en teixit limfoide associat a mucosa (MALT) degut al seu rol immunològic fonamental com a primera línia de defensa enfront a un agent d'estrès i/o patogen. Tanmateix, a l'actualitat es desconeix l'efecte del cortisol en el teixit limfoide associat a mucosa (MALT). Per aquest motiu, l'objectiu principal d'aquest estudi va ser avaluar l'efecte del cortisol en els tres principals MALTs: pell (SALT), brànquies (GIALT) i intestí (GALT). Per això, el teixits van ser incubats in vitro amb una concentració fisiològica de cortisol simulant una situació de estrès agut (100 ng/100 mg de teixit). L'efecte del cortisol a nivell local, es va avaluar al cap de 2h, 4h, 24h de tractament mitjançant real-time PCR amb el propòsit de determinar la modulació de diferents gens relacionats amb la resposta pro-inflamatòria (interleucina 1β i 6, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) i ciclooxigenasa(COX2)), anit-inflamatòria (interleucina 10, factor de creixement transformant beta) i la expressió gènica de gens relacionats amb la resposta a l'estrès (receptors glucocorticoides (GR) i proteïna de xoc tèrmic 70kDA). Com a model d'estudi es va utilitzar la daurada (Sparus aurata ) i la truita (Oncorhynchus mykiss ) amb l'objectiu de determinar si la modulació de gens en resposta a la presència de cortisol és conservada entre espècies. Mentre que a la pell de daurada no es va observar cap modulació dels gens avaluats, a la truita si que es va observar un augment de la expressió de TNF-α i GR a las 4 hores de tractament. A l'intestí, es va observar la modulació de IL-1β i COX2 a las 24 hores d'incubació a la daurada, mentre que a la truita només es va registrar l'expressió de COX2. A les brànquies no es van observar diferències significatives a cap de las dues espècies. En conclusió, els nostres resultats indiquen que la incubació de cortisol als MALT produeixen un efecte estimulador, encara que reduït, a la modulació de gens associats a la resposta immunològica i d'estrès a nivell de teixit associat a mucosa a les dues espècies estudiades.

Los peces en acuicultura están permanentemente bajo los efectos de distintos estímulos externos, algunos de ellos pueden convertirse estresores. Dependiendo de su magnitud y duración, éstos pueden dar lugar a una respuesta fisiológica con el objetivo de mantener la homeostasis del organismo y así preservar el estado de bienestar. Sin embargo, la respuesta al estrés puede provocar efectos colaterales en otro tipo de mecanismos como la respuesta inmunológica. La activación de los mecanismos fisiológicos durante episodios de estrés liberan distintas hormonas, siendo el cortisol la hormona más relevante en la respuesta al estrés en teleósteos. El cortisol no sólo es responsable de coordinar una serie de procesos destinados a generar una respuesta frente al estímulo externo, sino que también repercute en la modulación del sistema inmunológico. En estudios previos se ha reportado que el cortisol liberado frente a una respuesta de estrés agudo (estímulo de corta duración y alta intensidad) provoca un efecto inmunoestimulante a nivel sistémico. Actualmente, un creciente interés se ha centrado en la respuesta a nivel local del tejido linfoide asociado a mucosa (MALT) debido a su rol inmunológico fundamental como primera línea de defensa frente a un agente estresor y/o patógeno. Sin embargo, en la actualidad se desconoce el efecto del cortisol en el tejido linfoide asociado a mucosa (MALT). Por tal motivo, el objetivo principal de este estudio fue evaluar el efecto del cortisol en los tres principales MALTs: piel (SALT), branquias (GIALT) e intestino (GALT). Para ello, los tejidos fueron incubados in vitro con una concentración fisiológica de cortisol simulando una situación de estrés agudo (100 ng/100 mg de tejido). El efecto del cortisol a nivel local, se evaluó al cabo de 2h, 4h, y 24h de tratamiento mediante real-time PCR con el propósito de determinar la modulación de distintos genes relacionados con la respuesta inmunológica pro-inflamatoria (interleucina 1β (IL-1β) y 6, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y ciclooxigenasa (COX2)), anti-inflamatoria (interleucina 10, factor de crecimiento transformante beta) y la expresión génica de genes relacionados con la respuesta al estrés (receptor glucocorticoide (GR), proteína de choque térmico 70 kDA). Como modelo de estudio se utilizó la dorada (Sparus aurata) y trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) con el objetivo de determinar si la modulación de genes en respuesta a la presencia de cortisol es conservada entre especies. Mientras que en piel de dorada no se observó ninguna modulación en los genes evaluados, en trucha sí se observó un aumento de la expresión de TNF-α y GR a las 4 horas de tratamiento. En intestino, se observó la modulación de IL-1β y COX2 a las 24 horas de incubación en dorada, pero que en trucha solo fue registrada la expresión de COX2 . En branquias no se observó diferencias significativas en ambas especies. En conclusión, nuestros resultados indican que la incubación de cortisol en MALT produce un efecto estimulatorio, aunque reducido, de la modulación de genes asociados a la respuesta inmunológica y de estrés a nivel de tejido asociado a mucosas en ambas especies estudiadas.