Pèptids AT-Hook i proteïna HMGA1a(A50-91) humana. Expressió, purificació i cristal·lització amb oligonucleòtids

Abstract

La proteïna HMGA1a humana és una proteïna que es troba al nucli de les cèl·lules i que pot modificar la conformació espacial del DNA regulant l’expressió de molts gens. Se sap que la interacció es dóna a través d’uns motius d’unió al DNA denominats AT-hooks que s’uneixen preferentment a regions riques en ATs del solc estret del DNA. D’aquesta manera l’HMGA1a influeix en molts processos cel·lulars normals com són el creixement cel·lular, la diferenciació cel·lular o la reparació del DNA. D’altra banda, les proteïnes HMGA estan relacionades amb nombrosos processos patològics, entre ells el càncer. Per a comprendre com actua aquesta proteïna és molt important arribar a determinar l’estructura tridimensional dels seus complexos amb el DNA. Amb aquest objectiu s'ha intentat aconseguir complexos cristal·litzats d'aquesta proteïna o motius d'unió al DNA (pèptids AT-hook) amb oligonucleòtids. Concretament s’ha treballat amb la forma HMGA1a(A50-91) i els pèptids corresponents a les regions AT-hook I, II i III. Primerament s’ha obtingut la forma HMGA1a(A50-91) amb la tècnica del DNA recombinant mitjançant la seva expressió en un cultiu del bacteri Escherichia coli i s’ha purificat fins obtenir una fracció prou pura i concentrada pels estudis cristal·logràfics. Les tècniques emprades han estat la cromatografia de bescanvi iònic i la de gel filtració. En segon lloc, s’han realitzat tot un seguit d’assajos cristal·logràfics mitjançant la tècnica de difusió de vapor amb gota penjada: - Proteïna HMGA1a(A50-91) amb els següents oligonucleòtids: CGCAT2A2TGCG, A2TA2T2AT2 iCGCGAT2A2T. - Pèptids AT-hook amb els oligonucleòtids CGCAT2A2TGCG, A2TA2T2AT2, CGCGAT2A2T i GGGAAATTCCTC. A partir dels vuitanta assajos realitzats, es van poder congelar vint-i-tres cristalls que van ser analitzats per difracció de raigs X al sincrotró de Grenoble (ESRF). Finalment, s’han obtingut els paràmetres de la cel·la unitària i el sistema cristal·lí de dos complexos de pèptid-DNA.